10. TECNOLOGÍA Y APLICACIONES DEL ADN RECOMBIANTE PDF

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apuntes genética II...

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TECNOLOGÍA Y APLICACIONES DEL ADN RECOMBIANTE

ADN recombinante: combinaciones de moléculas de ADN que no están juntas en la naturaleza Tecnología del ADN recombinante: técnicas que permiten localizar, aislar, modificar y analizar fragmentos de ADN y que implican la construcción de una molécula de ADN, partiendo dos moléculas de ADN de origen distinto. Ingeniería genética: aplicación práctica de las tecnologías del ADN recombinante a problemas biológicos, médicos o agrícolas Biotecnología: uso de organismos vivos, o de sus productos, para beneficio humano o del entorno

ENZIMAS DE RESRTICCIÓN Las enzimas de restricción fueron descubiertas en 1970 y son una herramienta clave, porque son endonucleasas (enzimas que cortan las dos cadenas de ADN) pero tienen la peculiaridad de que reconocen de manera específica ciertas secuencias (normalmente palíndromos).

CLONACIÓN Se necesita una secuencia de ADN que se desea clonar más un vector de clonación. Se va a formar un ADN híbrido. También se necesita un organismo huésped, normalmente una bacteria. Después se seleccionan los huéspedes portadores de los vectores.

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VECTORES Los vectores son moléculas transportadoras de ADN. Existen diferentes tipos que se diferencian en función de: -

Especificidad de la células huésped Tamaño de los insertos Número de copias que producen Genes de selección

Qué características tiene que tener un vector de clonación: -

-

-

Tiene que tener un origen de replicación para que replique la molécula de ADN que a mí me interesa Tiene que llevar marcadores de selección. Algo que nos permita seleccionar de las células huepedes aquellas que llevan el vector, normalemente son genes de resistencia a antibióticos Tiene que tener puntos de corte de restricción únicos para tener solo un lugar de inserción.

PLÁSMIDOS Son pequeños elementos celulares que aparecen en algunas bacterias. Tienen un origen de replicación. Pueden albergan hasta 15 kb. Puede dar lugar a 500 copias por célula. Sitio de clonación múltiple: polylinker. Son fáciles de identificar, los plásmidos recombinantes.

Primero seleccionas con tetraciclina y después con ampicilina. Las que no sean resistentes a la ampicilina serán las que lleven el plásmido. TEMA 10 TECNOLOGÍA Y APLICACIONES DEL ADN RECOMBINANTE 2

En el otro caso si tenemos que incluirlo en donde están los puntos de restricción únicos (zona roja) entonces rompemos el gen de la beta galactosidasa. Primero hacemos la selección con ampicilina y en mismo medio incluiremos el iptg y el xgal.

INTRODUCCIÓN EN LA BACTERIA: TRANSFORMACIÓN Consiste en la introducción de un fragmento de ADN en una bacteria Se utiliza en algunos casos para hacer mapeo genético Las células deben de estar en un estado de competencia para que facilite la entrada. Se puede hacer en laboratorio.

Otra de las formas por las que se puede introducir ADN exógeno es por electroporacion La electroporación o electropermeabilización consiste en provocar un aumento significativo de la conductividad eléctrica y la permeabilidad de la membrana plasmática celular mediante un campo eléctrico aplicado externamente. Es habitual en biología molecular como forma de introducción de diferentes sustancias en células, como por ejemplo sondas moleculares, un fármaco que puede cambiar las funciones celulares o un fragmento de DNA codificante, como puede ser un plásmido. También se pueden utilizar otro tipo de vectores como es el fago lambda. La ventaja es que admite tamaños más grandes. Son fagos modificados. La introducción en la bacteria se produce mediante una infección vírica.

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CÓSMIDOS Hibridos entre plásmidos y el fago lambda. Son plásmidos empaquetados en cápsides víricas. Tamaños hasta 50 kb de ADN La introducción en la bacteria se realiza mediante una infección vírica

CROMOSOMAS ARTIFICIALES BACTERIANOS (BACs) Se contruyen a partir del plásmido F.. Se introducen por electroporación Transporte de hasta 300 kb

Vectores eucariotas Cromosomas artificilaes de levaduras (YACs) Insertos de 100 a 1000 kb Tienen secuencias centroméricas y teloméricas lo que les permite replicarse.

VECTORES DE EXPRESIÓN PROCARIOTAS Llevan un promotor fuerte próximo a una diana para endonucleasas de restricción, de forma que el fragmento exógeno se inserta en las proximidades del promotor pero sin interrumpirlo, y se produce una gran expresión.

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También hay vectores de expresión en eucariotas y se utilizan como huéspedes las levaduras. Las levaduras pueden realizar modificaciones postranscripcionales que son necesarias para que las proteínas puedan realizar su función.

PROTEÍNAS RECOMBINANTES SINTETIZADAS EN LEVADURAS

LIBRERÍAS/BIBLIOTECAS -

Biblioteca genómica o genoteca: conjunto de clones que contiene el genoma de un organismo, debe contener al menos una copia de todas las secuencias Bibliotecas cromosómica Bibliotecas de cDNA: el ADN complementario es una copia de ADN obtenida a partir de ARNm obtenido en una población celular en un momento concreto

Una gentoteca debe contener al menos una copia de cada una de las secuencias del genoma de un organismo El número de clones necesarios para cumplir este requisito depende de: -

Tamaño del genoma que se va a clonar Tamaño de los insertos TEMA 10 TECNOLOGÍA Y APLICACIONES DEL ADN RECOMBINANTE 5

-

Nivel de probabilidad deseado de recuperación de una secuencia

El número de clones que necesitamos para tener una alta probabilidad de que todo el genoma esté representado en la genoteca puede estimarse a partir de la expresión:

Si lo que tenemos representado en la genoteca son todos los fragmentos hablamos de una genoteca genómica.

RASTREO BIBLIOTECA: 1. Cultivo en placa de los clones de la genoteca 2. Obtener replicas 3. Diseño de sonda 4. Marcaje sonda Por ejemplo quiero seleccionar un gen que codifica un factor de coagulación. Tengo todo el genoma humano en 14 mil clones de YAC. Se podría sintetizar una sonda que sea complementaria a una parte del gen. Una vez que yo tengo la sonda marcada lo que tengo que hacer es copia de réplicas en diferentes filtros. Después se meten los filtros en bolsas TEMA 10 TECNOLOGÍA Y APLICACIONES DEL ADN RECOMBINANTE 6

y se desnaturaliza el ADN. Introducimos la sonda, dejamos que hibride y dependiendo del marcaje que hagamos vamos a ver los resultados de una manera u otra (ejemplo placas de radiografía)

OBTENCIÓN DE MENSAJEROS Lo que primero tenemos que hacer es una extracción de ARN y después quedarnos solo con los ARN mensajeros. Los ARN mensajeros se caracterizan por la presencia de la cola de poli A. Entonces vamos a utilizar esa cola de poliA para obtener los mARN. Lo que tenemos que utilizar son primers de colas de poliT, complementarios a la cola de poliA.

SÍNTESIS DE cDNA Una vez que tenemos los mensajeros lo que necesitamos es sintetizar el complemetario a los ARNm. Se usa el RNAm en una reacción con el enzima transcriptasa inversa, se elonga una cadena de ADN complementaria a partir de RNAm mediante este enzima. Después se añade la RNAasa que degrada la cadena de ARN y una ADN polimesasa construye la segunda cadena del ADN (la cadena complementaria). Se obtiene un fragmento de cDNA que son los que se clonan en plásmidos o en vectores. La ventaja es que simplifica la cantidad de clones, la desventaja es que hay una importante parte del ADN que no se transcribe a ARN, por lo que no obtenemos información de estas secuencias. La forma de localizar un determinado gen es mediante hibridación in situ con la ayuda de una sonda. También sirve para detectar la presencia de mensajeros en un tejido.

Si nosotros tenemos una librería de una especie de anfibios reciente y queremos ver si existe un gen específico, qué harías para ver si existe ese gen en esa especie TEMA 10 TECNOLOGÍA Y APLICACIONES DEL ADN RECOMBINANTE 7

Si ese gen está caracterizado como en otras especies próximas creamos una sonda partiendo de la secuencia del gen de otra especie.

DESNATURALIZACIÓN NUCLEICOS

Y

RENATURALIZACIÓN

DE

ÁCIDOS

Desnaturalización: Rotura de los puentes de hidrógeno. Si se produce por calor se llama fusión. Tm. Temperatura en la que el 50% de las cadenas están desenrolladas

HIBRIDACIÓN MOLECULAR

Southern blot Consiste básicamente en transferir las moléculas de ADN que se encuentran en un gen después de realizar una electroforesis a un filtro para que nosotros podamos trabajar con él. Tenemos un gel con tres carriles. Lo que se hace es construir esta especie de cámara en la que tenemos una esponja en la que colocamos encima el gen y después un filtro. Encima colocamos papeles absorbes y encima de todo un peso. Esta construcción se utiliza un buffer. Se deja aproximadamente una noche y si funcionó bien, todo el ADN pasó al filtro. Después lo tienes que fijar. Luego se mete en la bolsa.

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Souther: transferencia de DNA a un filtro Northern blot: transferencia de ARN a un filtro Wester blor: transferencia de proteínas a un filtro

SECUENCIACIÓN: MÉTODO DE SANGER O DEL DIDEOXI (método basado en la replicación) Lo que se necesita es la cadena que nosotros queremos secuenciar, un primer, una DNA polimerasa, nucleótidos y una pequeña cantidad de nucleótidos dideoxi. Si nosotros en lugar de añadir un ddNTP no se va a unir al siguiente y la replicación se detiene (porque no tenemos el grupo OH)

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Cuatro tubos de reacción a los que se les añaden todos los componentes y en cada uno se añade un dideoxi. En el primer tubo (ddATP) si se incorpora la adenina en el segundo nucleótido la reacción se para pero si se incorpora la normal la reacción sigue. Por lo cual en cada uno de estos tubos vamos a tener moléculas de distinta longitud dependiendo de donde se introduzca el dideoxi. Los dideoxi normalmente están marcados. Una vez que están finalizadas las reacciones hacemos un gel de poliacrilamida (resolución más alta). Se deja correr el gen y después ese gel se va copiar en un filtro y se va a dejar en una placa de radiografía para que el marcaje nos indique en donde están los dideoxi marcados radiactivamente. Como tenemos cadenas de diferente longitud vamos a poder leer la secuencia de todo el gen. Las secuencias de abajo son las más ligeras. El de debajo de todo corresponde con el tubo de la guanina por lo que el primer nucleótido es la guanina. Obtenemos la secuencia complementaria a la cadena molde Con este tipo de técnica se podían secuenciar como máximo 800 pb. Esta es la base de los secuenciadores automáticos que se utilizan hoy en día. Pero en lugar de utilizar cuatro tubos diferentes solo se utiliza uno, en el cual se añaden todos los elementos pero los dideoxi se marcan con fluorocromos diferentes y el gel es un gel capilar y los datos se recogen en un ordenador. Puedes estar haciendo 96 reacciones a la vez. En este caso vamos a tener un elcroferograma. Tenemos la complementaria de la que nosotros introducimos (abajo 5´y arriba 3´)

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PIROSECUENCIACIÓN Uno de los métodos es el NGS que lo diseño la casa Roche con el aparato 454. Aproximadamente unas 700 MB al momento Lo que se haces es fragmentar el ADN en fragmentos más o menos uniformes por un proceso que se denomina nebulización. A ese fragmentos de ADN se le van a añadir dos adaptadores diferentes, un adaptador A y otro B. uno de estos va a servir para fijar el fragmento de ADN a una esfera y el otro va a servir como cebador. Controlando las concentraciones de las microsferas y la concentración de ADN lo que se pretende es que cada esfera sea portadora de una sola cadena de ADN. Lo primero que se hace es amplificar en esa esfera mediante una PCR normal, la esfera se va a llenar de cadenas de ADN. Estas microesferas se van a separar en placas microtite y lo que se va a hacer es utilizar de nuevo la replicación. Se van a llenar de nucleótidos estas placas y lo que va a suceder es la reacción C. Cuando se incorpora un nucleótido se libera un pirofosfato. Este pirofosfato junto con el sustrato va a dar lugar al ATP. Este ATP en presencia de luciferina y luciferasa va a emitir luz y va a ser recogido por una cámara. Una vez que se leyó con adenina se añade otro y se repite lo mismo. Se genera un pirograma

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MARCADORES MOLECULARES DE ADN Son secuencias de ADN variables que se pueden utilizar para marcar (su herencia puede deterctarse por técnicas moleculares) una posición de un mapa genético Existen diferentes tipos: RFLP. Actualmente se utiliza poco. Se utilizaron para hacer marcas en los cromosomas para poder mapear genes. Si nosotros tenemos un cromosoma que tienen un punto de corte vamos a tener dos fragmentos y si no tiene punto de corte no va a haber un único fragmento.

Tenemos este pedigrí de tres generaciones. Tenemos datos de fragmentos de restricción para un encima determinado. Los individuos que están afectados por la actividad tienen un corte de 5 y de 2. Mientras que los individuos normales solo tienen el alelo A.

Herencia autosómica ligada a X dominante.

dominante o

En principio el polimorfismo de A no lo podemos asociar con esa característica Con B casi todos los sanos tienen las mismas características sin embargo los individuos que tienen la enfermedad tienen una banda de 5, 3 y 1. Lo que es común a todo ellos es la banda de cinco. Si nosotros sabemos en que banda está el polimorfismo podemos encontrar el gen.

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VNTR -

Minisatélites, que tienen de 6 a 65 pares de bases y se pueden repetir entre 5-50 veces. Ejemplo las secuencias telométicas. Microsatélites entre 2-4 pares de bases. Repeticiones de hasta 50 veces. También se les llama STR

Se definían alelos en función del tamaño de las repeticiones.

Se hacía un gel y se utilizaba una sonda para teñirlo. Leemos en el gel.

PCR: polymerase chain reaction:

Utilizando la PCR. Se diseñan unos primers. Lo que se obtienen es un gel que nos da diferentes tamaños. TEMA 10 TECNOLOGÍA Y APLICACIONES DEL ADN RECOMBINANTE 13

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Método para clonar fragmentos de ADN Se necesita información previa de la secuencia que se quiere amplificar Se necesita una polimerasa resistente al calor Se repiten ciclos de desnaturalización, hibridación y extensión

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25 ciclos incrementan las copias 106 veces Alta sensibilidad: se amplifica a partir de pequeñas cantidades de ADN e incluso a partir de ADN parcialmente degradado

LIMITACIONES:   

Conocimiento previo de la secuencia que se quiere amplificar Problemas de contaminación No se pueden amplificar tamaños mayores de 50 kb.

Los STR son importantes para obtener la huella digital humana. Es un código de barras, que es el resultado de realizar el perfil de entre 14 y 16 STR. Es decir, los marcadores de ADN no solo sirven para establecer señales dentro de los cromosomas sino también para otras funciones. Se utilizan STR porque estos se caracterizan porque son hipervariables.

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RAPDs: fragmentos de ADN polimórfico amplificados al azar

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ELECTROFORESIS EN GEL

CARTOGRAFÍA DE RESTRICCIÓN

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