12. Ciclo de Krebs - Summary Lehninger Principles of Biochemistry PDF

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El ciclo del (Cap 16) Para la mayor parte de y un gran de bacterias que viven en condiciones y oxidan sus combustibles a de carbono y agua, la no es sino la primera etapa de la completa de la glucosa. El piruvato formado en la en vez de ser reducido a lactato, etanol o otro producto de sufre una may...

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El ciclo del ácido cítrico (Cap 16) Para la mayor parte de células eucarióticas y un gran número de bacterias que viven en condiciones aeróbicas y oxidan sus combustibles orgánicos a dióxido de carbono y agua, la glucólisis no es sino la primera etapa de la oxidación completa de la glucosa. El piruvato formado en la glucólisis en vez de ser reducido a lactato, etanol o algún otro producto de fermentación, sufre una oxidación mayor hasta H 2O y CO2. Esta fase aeróbica del catabolismo se denomina respiración. Los bioquímicos y los biólogos celulares utilizan este término en un sentido más estricto para referirse a los procesos moleculares mediante los cuales las células consumen O2 y producen CO2, procesos conocidos más precisamente como respiración celular. La respiración celular tiene lugar en tres fases principales: En la primera, las moléculas de combustible orgánico (glucosa, ácidos grasos y algunos aminoácidos) se oxidan para dar lugar a fragmentos de dos átomos de carbono en forma del grupo acetilo del acetil-coenzima A (acetil-CoA). En la segunda fase, los grullos acetilo se incorporan al ciclo del ácido cítrico, donde son oxidados enzimáticamente hasta CO2. La energía liberada en esta oxidación se conserva en los transportadores de electrones reducidos NADH y FADH 2. En la tercera fase de la respiración, estos coenzimas reducidos son a su vez oxidados, liberando protones (H+) y electrones. Los electrones son transferidos a lo largo de una cadena de moléculas transportadoras (conocida como cadena respiratoria) al O2, el aceptor electrónico final. Durante este proceso de transferencia electrónica se libera una gran cantidad de energía, que se conserva en forma de ATP gracias al proceso denominado fosforilación oxidativa Consideraremos en primer lugar la conversión del piruvato en grupos acetilo, seguido por la entrada de estos grupos en el ciclo del ácido cítrico, llamado también ciclo de los ácidos tricarboxílicos (ciclo TCA) o ciclo de Krebs.

Producción de acetil-CoA (acetato activado) En los organismos aeróbicos, la glucosa y otros azúcares, los ácidos grasos y la mayor parte de los aminoácidos se oxidan finalmente a CO2 y H2O a través del ciclo del ácido cítrico y la cadena respiratoria. Antes de entrar en el ciclo del ácido cítrico, los esqueletos carbonados de azúcares y ácidos grasos deben ser degradados al grupo acetilo del acetil-CoA, la forma en que el ciclo del ácido cítrico acepta la mayor parte del combustible aportado. Muchos de los carbonos de los aminoácidos también entran en el ciclo de esta forma, aunque las vías de degradación de algunos aminoácidos dan lugar a otros intermediarios del ciclo.

El piruvato se oxida a acetil-CoA y CO 2 La reacción global catalizada por el complejo de la piruvato deshidrogenasa es una descarboxilación oxidativa, un proceso de oxidación irreversible en el que el piruvato pierde un grupo carboxilo en forma de molécula de CO2 y los dos carbonos restantes se transforman en el grupo acetilo del acetil-CoA. El NADH formado en esta reacción libera un ión hidruro (:H-) a la cadena respiratoria, que transporta los dos electrones hasta el oxígeno o, en los microorganismos anaeróbicos, hasta un aceptor de electrones alternativo tal como el nitrato o el sulfato.

El complejo de la piruvato deshidrogenasa necesita cinco coenzimas La deshidrogenación y descarboxilación combinadas del piruvato para formar el grupo acetilo del acetil-CoA requiere la acción secuencial de tres enzimas diferentes, así como de cinco coenzimas o grupos prostéticos diferentes: tiamina pirofosfato (TPP), flavina adenina dinucleótido (FAD), coenzima A (CoA, a veces mostrado como CoA-SH para poner de relieve el papel del grupo —SH), nicotinamida adenina dinucleótido (NAD) y lipoato. Cuatro vitaminas diferentes, esenciales en la nutrición humana, son componentes vitales de este sistema: la tiamina (en el TPP), la riboflavina (en el FAD), la nicotinamida (en el NAD) y el pantotenato (en el CoA). El coenzima A contiene un grupo tiol reactivo (—SH), de importancia fundamental dentro de su papel como transportador de grupos acilo en diversas reacciones metabólicas. Los grupos acilo se unen covalentemente al grupo tiol, formando tioésteres. A consecuencia de su relativamente elevada energía libre de hidrólisis los tioésteres tienen un elevado potencial de transferencia de grupos acilo que les permite ceder estos grupos a diversas moléculas aceptoras. De este modo, puede considerarse que el grupo acilo unido al coenzima A, está “activado” para la transferencia de grupo.

El quinto cofactor del complejo de la PDH, el lipoato, tiene dos grupos tiol que pueden experimentar una oxidación reversible hasta formar un enlace disulfuro (—S—S—), similar al que se produce entre dos residuos Cys en proteínas. Gracias a esta capacidad de experimentar reacciones de oxidación-reducción, el lipoato puede actuar a la vez como transportador de electrones (hidrógeno) y de acilos.

El complejo de la piruvato deshidrogenasa está formado por tres enzimas diferentes El complejo de la PDH está formado por copias múltiples de los tres enzimas: piruvato deshidrogenasa (E1), dihidrolipoil transacetilasa (E2) y dihidrolipoil deshidrogenasa (E3). El sitio activo de E1 contiene TPP unido y el de E3 contiene FAD unido. Existen además dos proteínas reguladoras, una proteína quinasa y una fosfoproteína fosfatasa, que también forman parte del complejo y que se describen posteriormente. Esta estructura básica E1-E2-E3 se ha conservado durante la evolución y se utiliza en diversa reacciones metabólicas similares, entre las que se incluyen la oxidación del α-cetoglutarato en el ciclo del ácido cítrico (descrita más adelante) y la oxidación de los αcetoácidos procedentes de la degradación de los aminoácidos de cadena ramificada valina, isoleucina y leucina.

En la canalización de sustratos, los intermedios nunca abandonan la superficie enzimática En la figura se muestra esquemáticamente de qué modo el complejo de la piruvato deshidrogenasa lleva a cabo las cinco reacciones consecutivas en la descarboxilación y deshidrogenación del piruvato. El paso ① es en esencia idéntico a la reacción catalizada por la piruvato descarboxilasa; el C-1 del piruvato se elimina en forma de CO2, y el C-2, que en el piruvato se encuentra en el estado de oxidación correspondiente a un aldehído, se une al TPP en forma de grupo hidroxietilo. Este primer paso es el más lento y, por tanto, limita la velocidad de la reacción global. Es también el punto en el que el complejo de la PDH ejerce su especificidad de sustrato. En el paso ② , el grupo hidroxietilo se oxida para dar lugar a un ácido carboxílico (acetato). Los dos electrones eliminados en esta reacción de oxidación reducen el —S—S— de un grupo lipoilo en E 2 para dar lugar a dos grupos tiol (—SH). La porción acetilo producida en esta reacción de oxidación-reducción se esterifica en primer lugar con uno de los grupos —SH del lipoilo, y a continuación se transesterifica con el CoA para dar acetil-CoA (paso ③ ). Así, la energía de oxidación impulsa la formación de un tioéster del acetato de elevada energía. El resto de las reacciones catalizadas por el complejo de la PDH (por E 3 en los pasos ④ y ⑤ ) son transferencias electrónicas necesarias para la regeneración de la forma oxidada (disulfuro) del grupo lipoilo de E2, preparando así el complejo enzimático para otro ciclo oxidativo. Los electrones extraídos del grupo hidroxietilo procedente del piruvato pasan a través del FAD al NAD+.

La secuencia de cinco reacciones mostrada en la figura es, por tanto, un ejemplo de canalización de sustratos. Los intermedios de la secuencia de varios pasos nunca abandonan el complejo, con lo que la concentración local del sustrato de E2 se mantiene siempre muy alta. La canalización también impide el robo del grupo acetilo activado por otros enzimas que utilizan este grupo como sustrato.

Reacciones del ciclo del ácido cítrico Podemos ahora seguir el proceso mediante el cual se oxida el acetil-CoA. Dicha transformación química se realiza en el ciclo del ácido cítrico, la primera via metabólica cíclica que hemos encontrado. Para iniciar una vuelta del ciclo el acetil-CoA cede su grupo acetilo al oxalacetato, un compuesto de cuatro átomos de carbono, formando una molécula de citrato de seis carbonos. El citrato se transforma entonces en isocitrato, otra molécula de seis carbonos, que al deshidrogenarse perdiendo CO2 genera α-cetoglutarato, un compuesto de cinco átomos de carbono también llamado oxoglutarato. El α-cetoglutarato sufre la pérdida de una segunda molécula de CO2, produciendo finalmente succinato de cuatro carbonos. A continuación el succinato se convierte mediante una secuencia de tres reacciones enzimáticas en el compuesto de cuatro carbonos oxalacetato, con lo que queda listo para reaccionar con otra molécula de acetil-CoA. En cada vuelta del ciclo se produce la entrada de un grupo acetilo (dos carbonos) en forma de acetil-CoA y la salida de dos moléculas de CO2; se utiliza una molécula de oxalacetato para formar citrato y se regenera una molécula de oxalacetato. No se produce una pérdida neta de oxalacetato; en teoría, una sola molécula de esto compuesto sería suficiente para promover la oxidación de un número infinito de grupos acetilo y de hecho el oxalacetato se encuentra en las células en concentraciones muy bajas. Cuatro de los ocho pasos de este proceso son oxidaciones en las que la energía de oxidación se conserva, con elevada eficiencia, en forma de los coenzimas reducidos NADH y FADH2.

Todas las reacciones del ciclo del ácido cítrico tienen lugar en la mitocondria. Las mitocondrias aisladas contienen no sólo todos los enzimas y coenzimas necesarios para el ciclo del ácido cítrico, sino también todos los enzimas y proteínas necesarios para que tenga lugar la última etapa de la respiración, es decir, la transferencia electrónica y la síntesis de ATP mediante fosforilación oxidativa.

El ciclo del ácido cítrico consta de ocho pasos Al examinar los ocho pasos consecutivos del ciclo del ácido cítrico, pondremos especial énfasis en las transformaciones químicas que tienen lugar cuando el citrato producido a partir de acetil-CoA y oxalacetato es oxidado, dando lugar a la aparición de CO2 al tiempo que la energía procedente de esta oxidación es almacenada en los coenzimas NADH y FADH 2 reducidos. ① Formación de citrato La primera reacción del ciclo es la condensación del acetil-CoA con oxalacetato para dar lugar a citrato, en una reacción catalizada por la citrato sintasa:

En esta reacción, el carbono metílico del grupo acetilo se une al grupo carboxílico (C-2) del oxalacetato. El citril-CoA es un intermediario transitorio que se forma en el sitio activo del enzima y que se hidroliza rápidamente a CoA y citrato libres, que a continuación abandonan el sitio activo. La hidrólisis de este intermediario tioéster de elevada energía hace que la reacción directa sea muy exergónica. La gran variación negativa de energía libre estándar asociada con la reacción de la citrato sintasa resulta esencial para el funcionamiento del ciclo a consecuencia, tal como se mencionó anteriormente, de la muy baja concentración de oxalacetato normalmente presente. El CoA liberado en esta reacción se recicla para participar en la descarboxilación oxidativa de otra molécula de piruvato a cargo del complejo de la PDH.

② Formación de isocitrato vía cis-aconitato El enzima aconitasa (denominado formalmente aconitato hidratasa) cataliza la transformación reversible del citrato en isocitrato a través de la formación intermedia del ácido tricarboxílico cisaconitato, que normalmente no se disocia del sitio activo. La aconitasa puede promover la adición reversible de H2O al doble enlace del cis-aconitato unido al enzima mediante dos vías diferentes, de las que una conduce a citrato y la otra a isocitrato:

③ Oxidación del isocitrato α-cetoglutarato y CO2

En el paso siguiente la isocitrato deshidrogenasa cataliza la descarboxilación oxidativa del isocitrato, dando lugar a la formación de α-cetoglutarato. El Mn2+ del sitio activo interacciona con el grupo carbonilo del intermedio oxalsuccinato que se forma fugazmente sin dejar el sitio de unión hasta que la descarboxilación lo convierte en α-cetoglutarato. El Mn2+ también estabiliza el enol formado transitoriamente por descarboxilación. Hay dos formas diferentes de isocitrato deshidrogenasa en todas las células, una de las cuales requiere NAD + como aceptor de electrones, mientras que la otra requiere NADP+. Por lo demás, las reacciones globales son idénticas. En las células eucarióticas el enzima dependiente de NAD se encuentra en la matriz mitocondrial y actúa en el ciclo del ácido cítrico. El enzima dependiente de NADP se encuentra tanto en la matriz mitocondrial como en el citosol.

④ Oxidación del α-cetoglutarato a succinil-CoA y CO2 El paso siguiente es otra descarboxilación oxidativa por la que el α-cetoglutarato se convierte en succinil-CoA y CO2 por acción del complejo de la α-cetoglutarato deshidrogenasa; el NAD+ actúa como aceptor de electrones y el CoA es el transportador del grupo succinilo. La energía de oxidación del α-cetoglutarato se conserva gracias a la formación del enlace tioéster del succinil-CoA:

⑤ Conversión de succinil-CoA en succinato El succinil-CoA, al igual que el acetil-CoA, tiene un enlace tioéster con una energía libre estándar de hidrólisis altamente negativa. En el paso siguiente del ciclo del ácido cítrico, la energía liberada en la rotura de este enlace se utiliza para promover la síntesis de un enlace fosfoanhídrido del GTP o del ATP. En el proceso se forma succinato. El enzima que cataliza esta reacción reversible se conoce como succinil-CoA sintetasa o succínico tioquinasa; ambos nombres indican la participación de un nucleósido trifosfato en la reacción. Esta reacción conservadora de energía presenta un paso intermedio en el que la misma molécula de enzima queda fosforilada en un residuo His en el sitio activo. Este grupo fosforilo, que posee un elevado potencial de transferencia de grupo, es

transferido a ADP (o bien GDP) para formar ATP (o bien GTP). Las células animales tienen dos isozimas de la succinil-CoA sintetasa, uno específico para ADP y otro para GDP. La formación de ATP (o GTP) a expensas de la energía liberada por la descarboxilación oxidativa del αcetoglutarato es una fosforilación a nivel de sustrato, como la síntesis de ATP en las reacciones glucolíticas catalizadas por la gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa y la piruvato quinasa. El GTP formado por la succinil-CoA sintetasa puede donar su grupo fosfato terminal al ADP para formar ATP, en una reacción reversible catalizada por la nucleósido difosfato quinasa: GTP + ADP → GDP + ATP Así, el resultado neto de la actividad de los dos isozimas de la succinil-CoA sintetasa es la conservación de la energía en forma de ATP. No hay ninguna variación de energía libre en la reacción de la nucleósido difosfato quinasa; el ATP y el GTP son energéticamente equivalentes. ⑥ Oxidación del succinato a fumarato El succinato formado a partir de succinil-CoA se oxida a fumarato por la flavoproteína succinato deshidrogenasa:

En eucariotas, la succinato deshidrogenasa se encuentra unida fuertemente a la membrana mitocondrial interna (en bacterias, a la membrana plasmática). El malonato, un análogo del succinato que no se encuentra normalmente en las células, es un fuerte inhibidor competitivo de la succinato deshidrogenasa y por lo tanto su adición a la mitocondria bloquea el ciclo del ácido cítrico ⑦ Hidratación del fumarato a malato La hidratación reversible del fumarato a L-malato está catalizada por la fumarasa (formalmente fumarato hidratasa). El estado de transición en esta reacción es un carbanión: Este enzima es altamente estereoespecífico; cataliza la hidratación del doble enlace en trans del fumarato, pero no el doble enlace en cís del maleato (el isómero cis del fumarato). En la dirección inversa (de D-malato a fumarato), la fumarasa es igualmente estereoespecífica: el D-malato no es un sustrato.

⑧ Oxidación del malato a oxalacetato

En la última reacción del ciclo del ácido cítrico, la L-malato deshidrogenasa ligada a NAD cataliza la oxidación del L-malato a oxalacetato:

El equilibrio de esta reacción se encuentra muy desplazado hacia la izquierda en condiciones termodinámicas estándar, pero en células intactas el oxalacetato es eliminado continuamente por la reacción altamente exergónica de la citrato sintasa. Esto mantiene la concentración intracelular de oxalacetato extremadamente baja, lo que empuja la reacción de la malato deshidrogenasa hacia la formación de oxalacetato.

La energía de las oxidaciones del ciclo se conserva eficientemente A pesar de que el ciclo del ácido cítrico en sí genera directamente sólo un ATP por vuelta (en la conversión de succinil-CoA a succinato), los cuatro pasos de oxidación en el ciclo proporcionan un gran flujo de electrones hacia la cadena respiratoria vía NADH y FADH2 y de este modo posibilita la formación de un gran número de moléculas de ATP durante la fosforilación oxidativa.

Los componentes del ciclo del ácido cítrico son importantes intermediarios biosintéticos En organismos aeróbicos, el ciclo del ácido cítrico es una ruta anfibólica, es decir, que sirve tanto para procesos anabólicos como catabólicos. Aparte de su papel en el catabolismo oxidativo de glúcidos, ácidos grasos y aminoácidos, el ciclo proporciona precursores para muchas vías biosintéticas.

Las reacciones anapleróticas reponen los intermediarios del ciclo del ácido cítrico. A medida que los intermediarios del ciclo del ácido cítrico son retirados para servir como precursores biosintéticos, son repuestos mediante reacciones anapleróticas. En circunstancias normales, las reacciones mediante las cuales intermediarios del ciclo se dirigen hacia otras vías y aquellas que permiten reponerlos se encuentran en equilibrio dinámico. Así pues, las concentraciones de los intermediarios del ciclo del ácido cítrico permanecen prácticamente constantes.

La tabla muestra las reacciones anaplerólicas más comunes; todas ellas convierten piruvato o fosfoenolpiruvato en oxalacetato o malato en diversos tejidos y organismos. La reacción anaplerótica más importante en hígado y riñon de mamíferos es la carboxilación reversible del piruvato por el CO2 para formar oxalacetato, catalizada por la piruvato carboxilasa. Cuando el ciclo del ácido cítrico carece de oxalacetato o de algún otro intermediario, se carboxila piruvato para producir más oxalacetato. La adición enzimática de un grupo carboxilo al piruvato requiere energía, que es aportada por el ATP; la energía libre necesaria para adicionar un grupo carboxilo al piruvato es aproximadamente igual a la energía libre disponible en el ATP. La piruvato carboxilasa es un enzima regulador y se encuentra prácticamente inactivo en ausencia de acelilCoA, su modulador alostérico positivo. Siempre que el acetil-CoA, el combustible del ciclo del ácido cítrico, está presente en exceso, se estimula la reacción de la piruvato carboxilasa para producir más oxalacetato, lo que permite que el ciclo utilice más acetil- CoA en la reacción de la citrato sintasa.

Las otras reacciones anapleróticas mostradas en la tabla están también reguladas para mantener el nivel de intermediarios suficientemente elevado como para sostener la actividad del ciclo del ácido cítrico.

Regulación del ciclo del ácido cítrico La regulación de enzimas clave de las vías metabólicas por efectores alostéricos y mediante modificación covalente asegura la producción de intermediarios a la velocidad requerida para mantener la célula en un estado estacionario estable y evita la innecesaria sobreproducción de los mismos. El flujo de átomos de carbono desde el piruvato hacia el ciclo del ácido cítrico y a través de él está sujeto a una estrecha regulación a dos niveles: la conversión del piruvato en acetil-CoA, el material de partida del ciclo (la reacción del complejo de la piruvato deshidrogenasa) y la entrada de acetil- CoA en el ciclo (la reacción de l...