6-Difusão e Osmose-aula prática (ADC) PDF

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DIFUSÃO E OSMOSE – aula prática Estudo da permeabilidade da membrana plasmática Objectivos 1. Descrever o movimento de moléculas como o demonstrado pelo movimento Browniano; 2. Explicar os factores que controlam a difusão de substâncias e que contribuem para a sua energia livre; 3. Prever a direcção e taxas relativas de difusão de moléculas de natureza diferente e com diferentes concentrações; 4. Descrever como uma membana semi-permeável afecta a difusão de moléculas; 5. Prever a direcção e taxa de osmose em meios hipotónicos, hipertónicos e isotónicos; 6. Descrever como uma solução hipotónica afecta o volume e integridade dos glóbulos vermelhos; 7. Descrever como uma solução hipertónica afecta o volume e integridade das células vegetais.

Movimento passivo de moléculas em sistemas biológicos • • • • • •

Observação de movimento Browniano Difusão de soluções de produtos de natureza diferente, com a mesma osmolaridade Difusão de soluções de uma mesma substância, com diferentes tonicidades Hemólise dos eritrócitos Plasmólise de células vegetais Taxa de osmose

Movimento Browniano Utilizar tinta-da-China numa gota de água e observar ao MO (400 X).

Plasmólise observada ao MO, em sistemas vivos A. Plasmólise de células vegetais (ex., Elodea ou células da película epidérmica interna da cebola) em resposta a soluções hipertónicas (concentração elevada/ solução saturada de NaCl no espaço extracelular) B. Plasmólise dos glóbulos vermelhos (numa solução saturada de NaCl) C. Hemólise observada ao MO - em eritrócitos (em água) Os glóbulos vermelhos (eritrócitos) constituem um modelo experimental útil no estudo da permeabilidade selectiva da membrana plasmática.

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Avaliação da taxa de hemólise dos eritrócitos: Por variação da turbidez: a olho nu ou num espectrofotómetro (a λ= 610 nm) Ensaios com soluções: a) Soluções isosmóticas com substâncias diferentes: NaCl 0.15 M; glicerol 0.3 M; sacarose 0.3 M, ureia 0.3 M b) Soluções de NaCl com diversas concentrações: NaCl a 0.3% (0.05 M), 0.6% (0.1 M) e 0.9% (0,15 M)

Registar o tempo de hemólise: Tabela 1. Tubo

Conteúdo

1

NaCl 0.15 M

2

Glicerol 0.3 M

3

Sacarose 0.3 M

4

Ureia 0.3 M

5

Água

Tempo de hemólise (4 gotas de sangue)

Registar o tempo de hemólise: Tabela 2. Tubo 1 2 3 4

Conteúdo

Concentração de NaCl (%)

6 ml H2O

0

4 ml H2O 2 ml NaCl 0,9% 2 ml H2O 4 ml NaCl 0,9% 0 ml H2O 6 ml NaCl 0,9%

Tempo de hemólise (4 gotas de sangue)

0,3 0,6 0,9

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Registar a variação de peso nas diferentes situações: Tabela 3. Peso dos sacos (g) Local Tempo (min.)

A

B

C

D

E

Saco

água água

Sacarose a 40% água

Sacarose a 60% água

água

Copo

Sacarose a 20% água

Sacarose a 60%

0 15 30 45 60

(Os sacos de membrana de diálise devem ser dobrados nas duas extremidades, e fechados com fio do Norte, de modo a não deixar ar mas deixando algum espaço sem solução)

Representar graficamente as variações de peso de cada saco, ao longo do tempo.

************** Trabalho proposto (em grupo) para apresentar na aula prática seguinte  

Elaboração de um protocolo experimental sobre o que foi executado na aula Apresentação e discussão dos resultados obtidos na aula

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! Preparação prévia do sangue

O sangue deve ser previamente preparado para eliminação de glóbulos rebentados, partículas, corpúsculos e plasma.

Proceder à “lavagem” do sangue, da seguinte forma: 1. Distribuir o sangue por vários tubos (de plástico) de centrífuga, pequenos, com tampa; 2. Centrifugar durante 2 a 4 minutos (não demasiado para evitar danificar as células), a 5-6000 g, para concentrar as células no fundo; 3. Retirar o sobrenadante (plasma sanguíneo); 4. Ressuspender com com uma solução isosmótica: NaCl 0.15 M (= 150 mM, ou =0.9%); também se poderia usar tampão fosfato 50 mM, tamponizado a pH 7, para guardar durante alguns dias; ou simplesmente soro fisiológico). 5. Repetir o processo várias vezes (ressuspender e centrifugar), até ter extraído todos os fragmentos celulares e plasma, ficando apenas as células íntegras; nota-se que está limpo quando deixar de se ver hemoglobina no sobrenadante.

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