Angiostrongylus cantonensis PDF

Preview

Summary

Infección de Angiostrongylus cantonensis y extracción de ADN para la investigación de polimorfismos genéticos ...

Description

Angiostrongylus cantonensis La infección por Angiostrongylus cantonensis ( angiostrongiliasis del sistema nervioso central [SNC]) representa la causa más común de meningitis eosinofílica infecciosa en humanos. Este nematodo, también conocido como gusano pulmonar de rata, ahora es endémico en la mayoría de las regiones tropicales y subtropicales del mundo, incluyendo el sureste de Asia, las islas del Pacífico, América del Sur y las islas del Caribe. Los seres humanos se infectan al ingerir larvas infecciosas de moluscos de la tercera etapa, mediante la ingestión intencional o accidental de moluscos infectados crudos, a través de vegetales frescos contaminados, o posiblemente agua contaminada. Además, varias especies de peces, camarones, anfibios, reptiles y planarios que sirven como hospedadores paraténicos han sido implicados como la fuente de infecciones humanas. La mayoría de los casos son autolimitados con recuperación completa, pero los casos graves pueden ser fatales o causar problemas neurológicos persistentes. Las manifestaciones clínicas típicas incluyen dolor de cabeza severo y persistente, rigidez del cuello, parestesias y parálisis del nervio craneal. La mayoría de los casos de angiostrongiliasis del SNC se diagnostican según los síntomas clínicos, la presencia de eosinofilia en el líquido cefalorraquídeo (LCR) y la exposición a una fuente potencial de larvas infecciosas. La confirmación de laboratorio de las infecciones es difícil ya que solo hay pocas pruebas disponibles. Encontrar la larva intacta durante el examen microscópico del LCR es definitivo, pero este hallazgo es raro, incluso en infecciones graves. La detección de anticuerpos producidos en respuesta a la infección (inmunodiagnóstico) se puede realizar en suero o LCR usando técnicas de inmunoabsorción ligada a enzimas (ELISA) o western blot (WB). Sin embargo, estos métodos no están estandarizados y su rendimiento diagnóstico puede variar dependiendo de la pureza de la preparación antigénica nativa utilizada. Cuando se usaron antígenos crudos, la sensibilidad fue del 100% para ELISA y del 69% para WB, mientras que la especificidad fue solo del 67% para ELISA y del 82% para WB. La purificación de los antígenos de 31 kDa dio como resultado un 100% de especificidad y sensibilidad tanto de ELISA como de WB, pero la dependencia de antígenos nativos hace que los ensayos sean difíciles de reproducir en otros laboratorios. Por lo tanto, el inmunodiagnóstico para la angiostrongiliasis solo está disponible en unos pocos laboratorios de investigación especializados en todo el mundo. Debido a estos desafíos diagnósticos, la enfermedad puede permanecer sin diagnosticar o confundirse con infecciones que causan síntomas similares. Los pacientes con diagnóstico sindrómico de meningitis habitualmente reciben una punción lumbar (LP) para recolectar LCR con fines diagnósticos y terapéuticos. Por lo tanto, el LCR es un tipo común de muestra disponible en pacientes con sospecha de angiostrongiliasis del SNC. Cuando las ratas de laboratorio se infectaron experimentalmente con A. cantonensis , el 52% (11/21) tenía ADN de A. cantonensis en su LCR detectado por reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (PCR) 60 días después de la infección, a pesar de la ausencia de larvas intactas en Su CSF (datos no publicados). Estos hallazgos hicieron posible que el LCR de al menos algunos humanos infectados pudiera contener niveles detectables de ADN de A. cantonensis . Un pequeño estudio en Tailandia de hecho encontró AngiostrongylusEl ADN en el LCR de cuatro de los 10 casos de angiostrongiliasis confirmados por serología utilizando una PCR estándar a nivel de género. 22 El objetivo de este trabajo fue evaluar si un ensayo de PCR en tiempo real específico de la especie,

originalmente desarrollado para detectar A. cantonensis en animales hospedadores, 23 podría ser adecuado para la detección de ADN de parásitos en muestras de LCR de pacientes con angiostrongiliasis del SNC (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4710426/).

Las regiones o genes seleccionados para amplificar se eligieron con base en los registros de otros artículos en los que se había empleado la región ITS-2 (Internal Transcribed Spacer) para el diagnóstico (26). 26: Detección de la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real del ADN de Angiostrongylus cantonensis en líquido cefalorraquídeo de pacientes con meningitis eosinofílica (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4710426/)

Con el fin de determinar y verificar los polimorfismos presentes en la región seleccionada para la amplificación mediante sondas Taq-Man™, se hizo un alineamiento múltiple utilizando las secuencias reportadas en las bases de datos del National Center for Biotechnology Information (NCBI) con el programa T-Coffee. Los alineamientos se visualizaron en MEGA 6 o Jalview. Polimorfismo: un polimorfismo es una variación en la secuencia de un lugar determinado del ADN en los cromosomas (locus) entre los individuos de una población. Alineamiento múltiple: Un alineamiento múltiple de secuencias (MSA, por sus siglas en inglés) es un alineamiento de tres o más secuencias biológicas, generalmente proteínas, ADN o ARN. En general, se asume que el conjunto de secuencias de consulta que se ingresa como entrada (conjunto problema) tienen una relación evolutiva por la cual comparten un linaje y descienden de un ancestro común. Los alineamientos múltiples de secuencias también se refieren al proceso de alinearlas como un conjunto de secuencias. Como puede ser difícil alinear a mano tres o más secuencias de longitud biológicamente relevante, y casi siempre consume mucho tiempo, se utilizan algoritmos computacionales para producir y analizar los alineamientos. T-coffee: es un software para el alineamiento múltiple de secuencias que utiliza un enfoque progresivo. Genera una biblioteca de alineamientos de pares para guiar el alineamiento múltiple de secuencias. Jalview: es una pieza de software de bioinformática que se utiliza para ver y editar múltiples alineaciones de secuencias .

En la región seleccionada, el polimorfismo en las tres especies fue suficiente para el diseño específico de los cebadores y de las sondas TaqMan™. Con el programa Primer Quest se obtuvieron las secuencias de los cebadores a partir de aquellas preseleccionadas en la herramienta BLAST para la ITS-2 intraespecie. Se tuvieron en cuenta parámetros como el tamaño del cebador, la temperatura media de fusión, el contenido de guanina-citosina (GC) (%GC) y el tamaño de la secuencia que debía amplificarse. Con el programa Oligoanalyzer, se evaluó la formación de estructuras secundarias y de homodímeros o heterodímeros según el delta de G (ΔG) generado. Posteriormente, con la herramienta Blastprimer (NCBI), se evaluó la posibilidad de alineamientos inespecíficos de los cebadores frente al genoma humano y otros parásitos. Con el programa Clustal W, se realizó un alineamiento múltiple entre las secuencias elegidas y los cebadores para garantizar el alineamiento tanto en sentido como en antisentido y la amplificación específica de cada una de las secuencias blanco Vs. las secuencias de otras especies (humanos, nematodos y caracol africano). Obtención de parásitos de Achatina fulica Se recolectaron 60 caracoles en Santa Fe de Antioquia. Se sacrificaron y trocearon para digerirlos en ácido clorhídrico (HCl) al 0,7 %. Luego se recuperaron las larvas de los nematodos con el método de Bearmann (25,26); se observaron con un estereomicroscopio Nikon SMZ445 y se contaron. El 70 % de las larvas de cada caracol se lavó con suero fisiológico y se almacenó en alcohol al 96 % y a 4 °C para la extracción de ADN; el 30 % restante se procesó para su observación y descripción bajo microscopio convencional y de barrido. Se tomaron fotografías y videos (no se muestran).

Estereomicroscopio: Es un tipo de microscopio óptico. Se utiliza para trabajar con muestras que tienen mayor necesidad de ser diseccionadas para ver con más detalle las partes pequeñas que las componen, sean de plantas, insectos e incluso paneles electrónicos

Extracción del ADN El ADN de los parásitos se extrajo con el estuche DNeasy Blood & Tissue® (Qiagen, Hilden, Alemania) según el protocolo del fabricante. Se cuantificó en un espectrofotómetro Nanodrop ND1000® (Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA) y se conservó en un congelador a -20 °C hasta su amplificación. La calidad del ADN purificado se evaluó por electroforesis convencional en un gel de agarosa al 2,0 %, y se determinó su pureza de extracción en relación con una absorbancia de 260/280 unidades de densidad óptica (DO). En el gel se utilizó un volumen de 5 µl del colorante de ADN SafeView™, la fluorescencia del producto de PCR se visualizó y la imagen se almacenó en un documentador de imágenes Gel Doc® (Bio-Rad). El ADN se almacenó en un congelador a -20 °C hasta su procesamiento. Estuche DNeasy Blood & Tissue: https://www.qiagen.com/us/shop/sampletechnologies/dna/genomic-dna/dneasy-blood-and-tissue-kit/#productdetails

Se cuantificó en un espectrofotómetro Nanodrop ND1000®: http://www.idipaz.es/ficheros/files/Que%20es/2015/NANODROP(2).pdf ADN SafeView™: https://www.abmgood.com/SYBR-Safe-DNA-Stains.html#documents

Muestras evaluadas mediante PCR Se evaluaron inicialmente los controles positivos a partir del ADN total de Angiostrongylus spp. suministrado por pares internacionales: A. vasorum (Stefanski Institute of Parasitology, Polonia), A. vasorum (Universidad de Bristol, Reino Unido), A. cantonensis (Universidad de Hawaii), A. cantonensis (Fiocruz, Rio de Janeiro, Brasil) y A. costaricensis (Centro de Investigación en Enfermedades Tropicales (CIET), Universidad de Costa Rica). Como controles negativos, se utilizaron muestras de ADN de Strongyloides stercoralis, Ascaris lumbricoides, Trichuris trichiura, Ancylostoma duodenale-Necator americanus e Hymenolepis nana, ADN de humano (células de referencia de cultivo) y ADN de A. fulica

PCR convencional Con los controles positivos y negativos, se realizó una PCR convencional en un termociclador C1000 de Bio Rad para estandarizar las condiciones iniciales del programa de amplificación que se usaron luego en la qPCR. Se verificaron el tamaño y la especificidad de cada producto amplificado en un gel de agarosa al 2 %. El perfil térmico usado como patrón fue el siguiente: 95° C durante 3 minutos; 35 ciclos a 95 °C durante 30 segundos; 55 a 62 °C durante 1 minuto, y 72 °C durante 30 segundos. Luego se sometieron a 72 °C durante 4 minutos para garantizar que todos los productos de amplificación estuvieran terminados y con la misma longitud. El volumen final de esta reacción fue de 25 µl.

PCR en tiempo real con sonda Taq-Man™ La qPCR se hizo utilizando cada oligonucleótido y cada sonda en una concentración entre 0,1 y 0,5 pmol/µl (no se mencionan las secuencias usadas para proteger el proceso de solicitud de patente). La mezcla de reacción que se usó para la amplificación fue el estuche QuantiTect Multiplex PCR NoROX® (Qiagen). Se utilizó una concentración de ADN de 9 a 14 ng/µl por muestra, para un volumen final de 25 µl por reacción. La reacción se llevó a cabo en el termociclador SmartCycler Cepheid®. Las lecturas de fluorescencia de los controles positivos se hicieron después de la amplificación y se registraron los valores de ciclo umbral correspondientes a su positividad. Para determinar el programa final óptimo de amplificación, se utilizó un rango de temperatura entre 57 y 63 °C.

Durante el proceso de estandarización, los controles positivos y negativos se evaluaron como mínimo por triplicado para confirmar su reproducibilidad y, posteriormente, se calculó la eficiencia de la amplificacióncomo mínimo por triplicado para confirmar su reproducibilidad y, posteriormente, se calculó la eficiencia de la amplificación. Evaluación de la interferencia de ADN Para verificar la posible interferencia que genera el alto contenido de ADN en las muestras, se tomaron 14 ng de ADN total purificado del parásito (A. cantonensis, A. costaricensis y A. vasorum), se mezclaron con diferentes concentraciones de ADN extraído de caracoles A. fulica (1 ng/µl, 5 ng/µl, 10 ng/µl, 25 ng/µl, 75 ng/µl y 100 ng/µl) y, en cada caso, se hizo una qPCR múltiple. Aspectos éticos Este estudio contó con el aval del Comité de Ética para la Experimentación con Animales de la Universidad de Antioquia, Acta 93, 29 de enero de 2015. La prueba diagnóstica de amplificación de ADN se ajustó a la Resolución 008430, que establece los lineamientos científicos, técnicos y administrativos para la investigación en salud. Comité de Ética para la Experimentación con Animales de la Universidad de Antioquia, Acta 93, 29 de enero de 2015: FALTA INVESTIGAR...