Apoptosi Necrosi[ 630] PDF

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LEZIONE 13

MICROSCOPIA

20/11/2019

APOPTOSI E NECROSI: TECNICHE DI ANALISI PER UNA DIAGNOSI DIFFERENZIALE La morte cellulare, come si sa, avviene tramite apoptosi (morte cellulare programmata) e necrosi (morte accidentale per un danno irreversibile). ! NECROSI La necrosi è associata a circostanze non fisiologiche, che interrompono l’omeostasi cellulare; coinvolge gruppi più o meno estesi di cellule, è irreversibile, determina sempre risposta infiammatoria e può essere causata da una grande varietà di eventi (agenti chimici, infettivi, ipossia, agenti fisici, reazioni immunitarie ecc). ! La necrosi può essere preceduta da un danno subletale; quando però il danno è oltre una determinata soglia (che dipende dal tipo di tessuto), le cellule vanno in necrosi. ! Ovviamente questo processo provoca modificazioni morfologiche e biochimiche nella cellula:! - alterazione della membrana plasmatica, per non funzionamento delle pompe ioniche;! - passaggio conseguente di acqua e sodio all’interno della cellula;! - dispersione degli organuli;! - rigonfiamento dei mitocondri;! - fuoriuscita del contenuto dei lisosomi;! - condensazione e frammentazione del nucleo;! - lisi della cellula necrotica e fuoriuscita nell’ambiente circostante di enzimi proteolitici che danneggiano le cellule vicine, scatendando una risposta infiammatoria. ! APOPTOSI L’apoptosi invece è un processo attivo, che richiede ATP, in cui la cellula stessa accende uno specifico programma che ne determina la morte, indotta da segnali esogeni (radiazioni, farmaci, virus, tossine) o endogeni(carenza di fattori di sopravvivenza, danno al DNA, danno ossidativo, ipossia, misfolding proteico, perdita di adesione alla matrice extracellulare) e che serve ad eliminare cellule indesiderate o in sovranumero. ! Interessa la morte della singola cellula, senza danneggiare le cellule circostanti, motivo per il quale non c’è risposta infiammatoria da parte dell’organismo. ! Nell’apoptosi, una cascata di reazioni si susseguono in un ordine al fine di terminare la vita cellulare; molte di queste reazioni sono bloccabili in punti precisi sia dall’esterno che dall’interno. I residui cellulari vengono eliminati velocemente dai fagociti, evitando l’innesco della reazione infiammatoria. ! Le alterazioni morfologiche che si verificano nella cellula apoptotica sono il risultato dell’espressione di una serie di eventi molecolari regolati da specifici geni. ! Negli anni ’70 due studiosi cominciarono a studiare quali potessero essere i geni coinvolti nell’apoptosi: presero come organismo di riferimento un nematode, C. elegans, poichè risulta costituito da un numero costante di cellule. Studiando questi processi in C. elegans, si arrivò ad identificare tre geni, Ced9, Ced3, Ced4: il primo un inibitore, gli altri due degli attivatori. ! Il primo gene per l’apoptosi clonato nei mammiferi è stato bcl-2. Si è poi determinato che non è un gene solo, ma una famiglia di geni con componenti pro e anti-apoptotici. La sensibilità della cellula agli stimoli apoptotici dipende dall’equilibrio dei due gruppi di geni: quando i geni pro-apoptotici superano di numero quelli anti-apoptotici si innesca l’apoptosi. ! Da un punto di vista biochimico, si può distinguere tre fasi nell’apoptosi: induzione, esecuzione, riconoscimento e fagocitosi. ! 1  di 4 

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INDUZIONE La fase di induzione è sempre reversibile e regolabile; la cellula riceve segnali di morte per via estrinseca o intrinseca, ma può ricevere anche segnali di sopravvivenza; la morte viene innescata se i segnali di morte superano quelli di sopravvivenza. ! La via estrinseca si ha quando lo stimolo viene da fuori, e sono importanti perciò i recettori di membrana; la via intrinseca si ha con lo stimolo interno, ed è coinvolto il mitocondrio. ! Si ritiene che tali pathways siano regolabili e reversibili fino al momento in cui convergono nell’attivazione delle caspasi. ! Le caspasi sono enzimi proteolitici (proteasi) con una cisteina nel sito catalitico; operano il taglio proteolitico in corrispondenza di residui di acido aspartico nella proteina bersaglio. Sono presenti in tutte le cellule animali in forma inattiva, come pre-enzimi, composti da tre domini. ! Ci sono diverse classi di caspasi coinvolte nella morte cellulare programmata:! - caspasi 8,9,10,12 dette caspasi iniziatrici;! - 3,6,7 dette caspasi effettrici.! Le caspasi 8-9 attivano le caspasi effettrici. ! La via estrinseca di attivazione è legata a citochine (come FasL, TNFalfa, TNFbeta) espresse sulla membrana dei linfociti T citotossici. Il legame del Fas con i recettori di morte sulla cellula bersaglio provoca l’aggregazione dei recettori che determina il richiamo di proteine adattatrici, formando un complesso che provoca l’aggregazione della caspasi 8, che ha anche essa un dominio di morte, che una volta legata in forma di dimero al complesso recettore-proteina si attiva. ! Una volta attiva, la caspasi 8 attiva le caspasi effettrici, che agiranno sui propri substrati. ! Nella via intrenseca invece lo stimolo apoptotico provoca la trascrizione di geni proapoptotici, in particolare Bax e Bak, che portano alla formazione di pori nel mitocondrio e diminuzione del potenziale di membrana, che causano il rilascio del citocromo C nel citoplasma. Qui, il cytC si lega ad una proteina, APAF-1, formando degli oligomeri che reclutano la pro-caspasi 9, che si lega agli oligomeri. CytC, proteina citosolica, APAF-1 e pro-caspasi 9 formano un complesso detto apoptosoma, che in presenza di ATP attiva la pro-capsasi 9 in caspasi. ! In generale, in induzione si può bloccare il processo grazie a delle proteine che inibiscono le caspasi, chiamate proteine IAPs: entrano in gioco quando si è in una situazione di reversibilità, e a loro volta possono essere bloccate da proteine mitocondriali, chiamate Smac/DIABLO. ! ESECUZIONE Fase di attivazione delle caspasi effettrici. Agiscono su diversi substrati, che generano un’ulteriore cascata di eventi proteolitici e nucleolitici preordinati. ! Le caspasi effettrici agiscono in questo modo: ! - la caspasi 6 agisce sulla lamina A (le lamine compongono la lamina nucleare), provocando la dissoluzione della lamina nucleare e la conseguente rottura dell’involucro nucleare;! - la caspasi 7 agisce sulla proteina PARP-1, che agisce sulla riparazione del DNA; bloccando tale proteina, si blocca la riparazione del DNA;! - la caspasi 3 agisce invece sui filamenti del citoscheletro, oltre ad agire su un inibitore che normalmente inibisce una endonucleasi; degradando tale proteina inibitrice, libera la endonucleasi (CAD) che va a frammentare il DNA. La DNasi CAD frammenta il DNA 2  di 4 

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sempre in modo regolare, con frammenti costituiti da nucleosoma singolo o da gruppi di nucleosomi, quindi con peso regolare. ! RICONOSCIMENTO E FAGOCITOSI Dal punto di vista molecolare, vede l’attivazione delle transglutamminasi, enzimi dipendenti da calcio, che formano legami cross-link con le proteine del citosol e di membrana, contribuendo alla formazione di corpi apoptotici, che espongono in superficie la fosfatidilserina, riconosciuta dai macrofagi come segnale di fagocitosi. ! Se la cellula apoptotica non può essere fagocitata, esaurita l’energia disponibile, essa non riesce più a mantenere le proprietà di impermeabilità della membrana, e va incontro a necrosi secondaria. ! TECNICHE PER RICONOSCERE L’APOPTOSI Ci sono una serie di tecniche, atte a discriminare l’apoptosi rispetto alla necrosi. ! Ci sono tecniche che prevedono lo studio morfologico delle cellule, in MO, TEM, SEM, poichè la morfologia cellulare tra apoptosi e necrosi cambia molto. ! Oppure, si possono evidenziare alcuni eventi specifici: ad esempio, a livello del nucleo si può evidenziare la particolare frammentazione del DNA nel nucleo, utilizzando tecniche come elettroforesi, CFM ecc. ! Si possono studiare le modificazioni della membrana, evidenziando la fosfatidilserina presente nell’apoptosi sulla membrana marcandola con l’annessina V (cinque). ! Attraverso immunocitochimica e CFM si possono identificare le caspasi attivati. ! TECNICHE MORFOLOGICHE! La morfologia di una cellula in apoptosi è ben diversa dalla morfologia della necrosi. ! Osservando in MO un campione di rene, si osserva un glomerulo renale in necrosi per la presenza di grande risposta infiammatoria. ! Osservando delle cellule singole, se si nota la forma a mezzaluna della cromatina e il citoplasma più scuro, è una cellula in apoptosi. ! In ME è meglio ancora: si nota bene la condensazione della cromatina, la frammentazione del DNA e la formazione dei corpi apoptotici; nella necrosi, invece, il citoplasma è molto più rarefatto, il nucleo si frammenta in modo irregolare e c’è fuoriuscita di materiale cellulare all’esterno. ! MODIFICAZIONI NUCLEARI:LA FRAMMENTAZIONE DEL DNA! La frammentazione avviene ad opera di specifiche endonucleasi: facendo l’elettroforesi, la corsa elettroforetica del DNA in apoptosi si presenta con il ladder (scaletta) formato da frammenti di peso molecolare regolare; in necrosi, invece, i frammenti sono di peso vario, per lo più piccolo, per cui lo striscio appare continuo. ! Altre tecniche sono: ! - tecnica ISNT, che rileva rotture di un singolo filamento di DNA. Si incuba con DNA pol I in presenza di deossiribonucleotidi, è in grado di aggiungere nucleotidi legati a fluorescina. La DNA pol I è stampo-dipendente ed è incapace di agire sui tagli a doppia elica. ! - tecnica TUNEL, che rileva anche le rotture a doppio filamento; viene usato un enzima, il TdT, che catalizza l’aggiunta di desossiribonucleotidi all’estremità 3’ OH libere in corrispondenza di tagli sulla doppia e singola elica. Si usano BrdUTP (bromodesossiuridina) riconosciuti da anticorpi monoclonali, marcati in vario modo. I frammenti marcati si possono osservare in microscopia o in CFM. ! Tra le due, la reazione TUNEL è più specifica per l’apoptosi, mentre la ISNT può essere utile combinata con la TUNEL per differenziare l’apoptosi dalla necrosi. ! 3  di 4 

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VALUTZIONE DEL PICCO IPODIPLOIDE DOPO COLORAZIONE CON IODURO DI PROPIDIO IN CFM! Metodica di analisi del ciclo cellulare con ioduro di propidio per quantificare il DNA. ! Con la CFM si può valutare il contenuto di DNA anche nelle varie fasi del ciclo cellulare: in particolare, le cellule apoptotiche hanno un contenuto di DNA inferiore a 2C, poichè esso si frammenta. A tal proposito è possibile individuare il picco ipodiploide, in cui sono presenti tutte cellule in apoptosi. ! MODIFICAZIONI DELLA MEMBRANA! ESPOSIZIONE A FOSFATIDILSERINA (PS)! L’annessina V è una proteina che in presenza di calcio lega la PS con alta affinità. Le cellule normali, in cui PS è rivolta al citoplasma, non legano l’annessina, ma le cellule in apoptosi, che hanno i residui di PS esposti sul foglietto esterno della membrana, la legano. La coniugazione dell’annessina con un fluorocromo permette l’identificazione in citofluorimetria, o in microscopia, di cellule apoptotiche. ! La contemporanea marcatura delle cellule con annessina V e ioduro di propidio permette di discriminare, in doppia fluorescenza, fra cellule in apoptosi o in necrosi, poichè le prime hanno membrana integra e quindi sono negative per il PI, mentre le seconde sono positive per il PI in quanto la membrana è danneggiata (in necrosi sono positive per entrambi i marker). ! MODIFICAZIONI DELLE DIMENSIONI CELLULARI! La condensazione citoplasmatica provoca una modificazione dei parametri fisici valutati in CFM. Le cellule in apoptosi appaiono piú piccole (riduzione di FSC) e più granulose (aumento di SSC) a causa del cambio di indice di rifrazione citoplasmatica. ! Anche qui è possibile una analisi biparametrica, associando la misurazione del forward scatter FSC alla marcatura PI. ! MODIFICAZIONI MITOCONDRIALI! Un marker per rilevare queste modifiche è JC1, colorante cationico lipofilo e fluorescente che si localizza nel mitocondrio: nelle cellule vitali con alto potenziale di membrana, JC1 si localizza a livello della membrana mitocondriale sotto forma di aggregati, emettendo fluorescenza nel rosso. Quando il potenziale di membrana del mitocondrio diminuisce, come in apoptosi, il colorante si stacca dalla membrana e si localizza nel citoplasma sotto forma di monomeri, situazione in cui fluoresce in verde. In questo modo si valuta la presenza di apoptosi in base alla diversa emissione di fluorescenza. ! ATTIVAZIONE DELLE CASPASI: TECNICHE IMMUNOISTOCHIMICHE! Esistono una serie di anticorpi coniugabili con una serie di di fluorocromi, in grado di marcare le caspasi 3 quando sono già attive nel processo di apoptosi. !

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