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Auxina: l'ormone della crescita La forma e la funzione di organismi multicellulari non sarebbe possibile senza un efficiente comunicazione fra cellule, tessuti ed organi. Nelle piante superiori la regolazione e il coordinamento del metabolismo, dell'accrescimento e della morfogenesi dipendono da segnali che vanno da una parte all'altra della pianta. Nel diciannovesimo secolo, Julius von Sachs propose che fossero responsabili per la formazione e la crescita di differenti organi vegetali dei messaggeri chimici. Gli ormoni sono, appunto, messaggeri chimici prodotti in una cellula o in un tessuto e modulano i processi cellulari di un'altra cellula interagendo con proteine specifiche definite recettori. Come per gli animali, molti ormoni vegetali sono sintetizzati in un tessuto e agiscono in siti specifici di un altro tessuto a concentrazioni bassissime (10-6-10-9 M). Gli ormoni che sono trasportati ai siti di azione in tessuti distanti dal loro sito di sintesi sono definiti ormoni endocrini quelli che agiscono su cellule adiacenti alla fonte di sintesi sono, invece, definiti ormoni paracrini. Lo sviluppo delle piante è regolato da sei principali tipi di ormoni: auxine, gibberelline, citochine, etilene, acido abscissico e brassinosteroidi. L'auxina fu il primo ormone vegetale ad essere studiato nelle piante e, insieme alle citochine, differisce dagli altri ormoni vegetali per un aspetto importante: è necessario alla vitalità. Finora non sono stati trovati mutanti privi di ognuno di questi due ormoni, indicando che le mutazioni che li eliminano sono letali.

 Nascita del concetto di auxina Durante l'ultima parte del diciannovesimo secolo, Charles Darwin studiò quei fenomeni dell'accrescimento vegetale che riguardano i tropismi. Questo fenomeno, che è causato da un accrescimento asimmetrico, è definito fototropismo. In alcuni esperimenti Darwin usò una graminacea che aveva, come la maggior parte delle graminacee, le giovani foglie incapsulate in un organi protettivo che si chiama coleottile. I coleottili sono molto sensibili alla luce, specialmente a quella blu. Se vengono illuminati da una sola parte con un breve impulso di luce blu flebile essi si piegano (crescono) verso la sorgente luminosa. Darwin, scoprì inoltre che era la punta del coleottile che percepiva la luce, poiché se esso copriva la punta con un foglio il coleottile non si ripiegava. Ma la regione del coleottile responsabile del ripiegamento verso la luce, definita zona di accrescimento, si trovava a molti millimetri sotto l'apice. Quindi pensò che un certo segnale di crescita era prodotto nell'apice e successivamente raggiungeva la zona di crescita. Nel 1926, Frits Went, appoggiò l'idea di Darwin, e scoprì che nell'apice del coleottile di avena era presente un composto chimico che promuoveva la crescita. Infatti, se l'apice veniva reciso, l'accrescimento del coleottile si arrestava. Questo scienziato riuscì infine ad ottenere la sostanza che promuoveva l'allungamento ossia l'auxina (dal greco auxein che significa “aumentare” o “crescere”).  L’auxina principale: l’acido indol-3-acetico Alla metà degli anni '30 si determino che l'auxina è l'acido 3-indolacetico (IAA). Successivamente furono scoperte molte altre auxine nelle piante superiori, ma l'IAA è di gran lunga la più abbondante. Tra le altre auxine naturali troviamo l'acido 4-cloroindol-3-acetico nella pianta di pisello e l'acido indol-3-butirrico nella senape e il mais. Comunque, le auxine, a parte l'allungamento cellulare, sono in grado di avere un effetto su molti altri processi legati allo sviluppo. La biosintesi dell'IAA, è associata ai tessuti in rapida divisione e accrescimento, in particolar modo nel germoglio, quindi nei meristemi apicali dei germogli e le giovani foglie. L'IAA è strutturalmente imparentato con l'amminoacido triptofano e con il precursore del triptofano l'indol-3glicerolo fosfato, entrambi precursori per la biosintesi dell'IAA. Le tre principali vie metaboliche vegetali e la via batterica per la biosintesi di IAA dipendente dal triptofano sono la via TAM, la via IPA e la via IAN. 1) La via della triptammina (TAM) inizia con la decarbossilazione del triptofano per formare TAM. Una serie di reazioni enzimatiche converte quindi la triptammina in indol-3-acetaldeide (IAAld), che è quindi ossidata da

una deidrogenasi specifica a IAA. 2) Nella via del 3-indolacetonitrile (IAN), invece, il triptofano è prima convertito in indol-3-acetaldossima (IAOx) e poi in IAN. Successivamente, l'enzima che converte IAN in IAA è definito nitrilasi. 3) La via batterica, infine, è quella che utilizza l'indol-3-acerammide (IAM) come composto intermedio ed è utilizzata da molti batteri patogeni. Le auxine prodotte da questi batteri inducono spesso cambiamenti morfologici. Oltre alle vie dipendenti dal triptofano gli studi genetici indicano che le piante possono sintetizzare IAA tramite una o più vie indipendenti dal triptofano. Studi su mutanti auxotrofici per il triptofano di Arabidopsis stabilirono, infatti, che il ramo di inizio per la sintesi di IAA è sia l'indolo sia il suo precursore, l'indolo-3-glicerol fosfato. A parte i siti di sintesi, una porzione significativa di auxina presente nei tessuti è legata covalentemente a composti con alto e basso peso molecolare. Questo è il caso particolare dei semi e negli organi di riserva, quali i cotiledoni. Queste auxine coniugate o “legate” sono inattive ormonalmente. L'IAA è però rapidamente liberato da molti, ma non tutti, i coniugati tramite processi enzimatici. Il metabolismo di coniugati di auxina è il fattore principale nella regolazione della concentrazione di auxina libera. Inoltre, fattori ambientali come la luce e la gravità hanno dimostrato un effetto sia sulla velocità di coniugazione dell'auxina (rimozione di auxina libera) sia sul tasso di rilascio di auxina libera (idrolisi di auxina coniugata). Comunque, gli ormoni sarebbero inutili come segnali di sviluppo se si accumulassero nel tempo. Il catabolismo dell'auxina assicura la degradazione dell'ormone attivo quando la concentrazione eccede il livello ottimale o quando la risposta dell'ormone è completata. Come per la sua sintesi, la degradazione enzimatica (ossidazione) dell'IAA può coinvolgere più di una via metabolica. Per un determinato periodo si è pensato che la decarbossilazione dell'IAA a 3-metilenossindolo fosse la via principale di degradazione in quanto le perossidasi sono ubiquitarie nelle piante superiori. Ma vi sono altre due vie coinvolte nella degradazione dell'auxina: i prodotti finali di queste vie sono l'acido ossindolo-3-acetico (OxIAA) e l'OxIAAglucosio, per una via, e il coniugato IAA-aspartato è ossidato a OxIAA in un'altra via. La distribuzione dell'IAA e dei suoi metaboliti è stata, invece, studiata in cellule di tabacco. Circa un terzo dell'IAA è presente nel cloroplasto e il resto è localizzato nel citosol. Il triptofano è sintetizzato nel cloroplasto e un determinato numero di enzimi per la biosintesi dell'IAA contiene sequenze di localizzazione nel cloroplasto. Da ciò deriva che una parte della sintesi dell'IAA possa avvenire nel cloroplasto. Comunque, la concentrazione stazionaria nel citosol è determinata da numerosi processi interconnessi. I fattori che influiscono sulle concentrazioni stazionarie dell'IAA nelle cellule vegetali sono quindi molteplici. La biosintesi tramite la via triptofano-dipendente o triptofano-indipendente può portare solo ad un aumento della concentrazione di IAA libera. La degradazione (sia tramite ossidazione non decarbossilante sia decarbossilate) porta solo all'aumento della concentrazione di IAA, mentre la coniugazione è reversibile e può quindi portare sia all'incremento che alla diminuzione. Invece, il trasporto e la compartimentazione possono causare un aumento o una diminuzione della concentrazione citosolica dell'IAA, secondo la direzione del movimento dell'ormone.

 Trasporto dell'auxina Gli assi principali del germoglio e della radice, insieme alle loro ramificazioni, mostrano una polarità strutturale apice-base dipendente dalla polarità del trasporto dell'auxina. L'auxina, infatti, si muove principalmente dall'apice alla base (cioè, basipetamente) in singole sezioni di ipocotili. Questo tipo di trasporto unidirezionale è definito trasporto polare. L'auxina è l'unico ormone di crescita delle piante ad essere trasportato polarmente e il trasporto di questo ormone è presente in quasi tutte le piante, comprese le briofite e le felci. Siccome l'apice del germoglio è la fonte principale di auxina per tutta la pianta, il trasporto polare contribuisce alla formazione di un gradiente di auxina dal germoglio alla radice. Questo gradiente longitudinale agisce sui vari processi di sviluppo, compreso lo sviluppo embrionale, l'allungamento del fusto, la dominanza apicale, la cicatrizzazione delle ferite e la senescenza fogliare. I primi studi sul trasporto polare sono stati fatti utilizzando il metodo del blocco di agar donatore/ricevitore: un blocco di agar che contiene auxina marcata radioisotopicamente (blocco donatore) è posto all'estremità di

un segmento di tessuto e un blocco ricevitore è posto all'altra estremità. In questo modo, si può determinare, in un determinato lasso di tempo, il movimento dell'auxina attraverso il tessuto fino al ricevitore misurandone la radioattività. Sono emerse da studi come questo le proprietà generali del trasporto polare dell'IAA. I tessuti differiscono nel grado di polarità di trasporto di IAA. Nel coleottili, nei fusti e nei piccioli delle foglie predomina il trasporto basipeto (dall'apice alla base), mentre nei tessuti della stele della radice l'auxina è trasportata in maniera acropeta (nel tessuto floematico attraverso la traslocazione da sorgente a pozzo quindi verso l'apice). Il trasporto polare, inoltre, non è influito dall'orientamento del tessuto, essendo indipendente dalla gravità. Comunque, il trasporto polare procede da cellula a cellula, più che attraverso il simplasto. Cioè, l'auxina esce dalla cellula attraverso la membrana plasmatica, diffonde attraverso le due pareti primarie ed entra attraverso la membrana plasmatica della cellula sottostante. La perdita di auxina da una cellula è definita efflusso di auxina, mentre l'ingresso di auxina in una cellula è detto assorbimento o influsso di auxina. Questi processi richiedono energia metabolica. La velocità di trasporto polare va da 2 a 20 cm h-1 ed è più veloce della velocità di diffusione, ma più lenta della velocità di trasporto nel floema. Valori elevati della velocità di trasporto polare si osservano in tessuti immediatamente adiacenti ai meristemi apicali del germoglio e della radice. Il sito principale di trasporto polare dell'auxina nei fusti, foglie e radici è il tessuto parenchimatico vascolare, più probabilmente lo xilema. Nel parenchima vascolare la direzione generale del trasporto di auxina nella pianta è verso il basso, verso l'apice della radice. In altri termini, l'auxina è trasportata basipetamente nel germoglio e acropetamente nella radice. La scoperta alla fine degli anni '60 del meccanismo chemiosmotico per il trasporto dei soluti ha portato all'applicazione di questo modello per interpretare il trasporto polare dell'auxina. Secondo il modello chemiosmotico per il trasporto polare dell'auxina generalmente accettato, la forza proton motrice (ΔE + ΔpH) attraverso la membrana plasmatica è responsabile dell'assorbimento di auxina, mentre l'efflusso di auxina è causato solamente dal potenziale di membrana, ΔE. Una delle principali caratteristiche del modello di trasporto polare è che i carriers per l'efflusso di auxina sono localizzati soprattutto nella parte basale delle cellule conduttrici. In dettaglio, il primo passaggio nel trasporto polare dell'auxina è l'influsso. Secondo il modello l'auxina entra nelle cellule vegetali tramite due meccanismi: La diffusione passiva della forma protonata (IAAH) da qualsiasi direzione attraverso il bistrato fosfolipidico; Il trasporto attivo secondario della forma dissociata (IAA-) tramite un simportatore 2H+-IAA-. La forma indissociata dell'acido 3-indolacetico, in cui il gruppo carbossilico è protonato, è lipofila e diffonde facilmente attraverso il doppio strato lipidico delle membrane. Invece, la forma dissociata di IAA ha delle cariche negative e non può attraversare le membrane senza un aiuto. Poiché l'H+-ATPasi di membrana mantiene normalmente la soluzione della parete cellulare ad un pH con valore da 5 a 5,5, circa il 25% dell'auxina presente nell'apoplasto darà nella forma indissociata e diffonderà passivamente attraverso la membrana plasmatica secondo i gradiente di concentrazione. Esiste, inoltre, per la restante parte dell'auxina un meccanismo di assorbimento attivo secondario mediato da un carrier. Infatti, si ritiene, che in certi tessuti un simportatore H+-IAA- cotrasporti due protoni per ogni anione di auxina. Questo trasporto attivo secondario dell'auxina permette un maggior accumulo dell'ormone di quanto non permette la semplice diffusione, poiché è guidato attraverso la membrana dalla forza proton motrice. A questo punto, quando l'IAA entra nel citosol, che ha un pH di circa 7,2, si dissocia quasi tutto nella forma anionica. Poiché la membrana è meno permeabile all'IAA- dell'IAAH, l'IAA- tenderà ad accumularsi nel citosol. Comunque, la maggior parte dell'auxina che entra nella cellula esce tramite carriers di efflusso di auxina anionica. Secondo il modello chemiosmotico il trasporto di IAA- fuori dalla cellula è generato dal potenziale di membrana negativo all'interno. Una famiglia di proteine note come proteine PIN sono una componente importante dei complessi di efflusso dell'auxina. Queste proteine sono localizzate nel preciso luogo in cui il modello le prevede, cioè allineate secondo la direzione del trasporto di auxina. Comunque, le PIN sono proteine integrali di membrana con una debole attività di carrier di trasporto che possono facilitare il trasporto

interagendo con altre proteine. Comunque, i modelli di trasporto di auxina in tessuti intatti indica che il trasporto polare di auxina richiede anche un meccanismo dipendente dall'energia, specialmente nelle piccole cellule dei meristemi apicali, dove può avvenire una re-diffusione dell'auxina. Le cellule vegetali, infatti, contengono trasportatori ATP dipendenti che appartengono alla famiglia di glicoproteine P resistenti ai farmaci (MDR/PGP). Le proteine MDR/PGP (PGP) sono proteine integrali di membrana che hanno una funzione di carriers idrofobici ATP dipendenti nell'efflusso cellulare di auxina. Quindi l'influsso e l'efflusso di auxina nelle cellule può essere suddiviso in quattro passaggi: 1.La H+-ATPasi della membrana plasmatica pompa protoni nell'apoplasto. L'acidità dell'apoplasto influisce sulla velocità di trasporto dell'auxina alterando il rapporto fra IAAH e IAA- presente nell'apoplasto; 2.L'IAAH può entrare nella cellula tramite simportatori di protoni o tramite diffusione. Una volta entrata nel citosol l'IAA è un anione e può uscire dalla cellula solo tramite trasporto attivo; 3.Le P-glicoproteine sono localizzate non polarmente sulla membrana plasmatica e possono guidare l'efflusso attivo (dipendente da ATP) dell'auxina; 4.Il trasporto attivo polare sinergicamente aumentato avviene quando le proteine PIN localizzate polarmente si associano con le proteine PGP, superando gli effetti della retro-diffusione; Bisogna ricordare, inoltre, che l'auxina è anche trasportata in modo non polare nel floema. Infatti, gran parte dell'IAA sintetizzato in foglie mature è trasportato al reso della piante tramite un trasporto floematico non polare. Nella pianta l'auxina, insieme agli altri componenti del floema, si può spostare da queste foglie verso l'alto o il basso a velocità di gran lunga superiori a quelle del trasporto polare, sempre attraverso il modello “da sorgente a pozzo”. Comunque, il trasporto polare non è indipendente dal trasporto floematico e viceversa. Infatti studi di marcatura radioattiva indicano che l'auxina possa essere trasferita dalla via floematica non polare alla via di trasporto polare.

 Vie di traduzione del segnale auxinico Lo scopo finale della ricerca sui meccanismi molecolari di azione di un ormone è la ricostruzione di tutti i passaggi nella via di trasduzione del segnale, dal legame con il recettore alla risposta fisiologica. Nel caso dell'auxina questa è un impresa ardua in quanto l'ormone influisce su svariati processi fisiologici e di sviluppo. Comunque, i primi passaggi nella via di segale dell'auxina sono sorprendentemente semplici e comprendono il legame con un piccolo gruppo di recettori che regolano la degradazione proteica attraverso la via ubiquitina-proteasoma. A seguito dell'attivazione dovuta all'auxina il complesso enzima-recettore segna l'idrolisi di repressori specifici trascrizionali, portando all'attivazione (de-repressione) di geni che rispondono all'auxina. I principali recettori dell'auxina sono stati identificati come proteine solubili “F-box” appartenenti alla famiglia di proteine TIR1/AFB. Le F-box sono motivi proteici di circa 50 amminoacidi che fungono da siti di interazione proteina-proteina. Le proteine F-box sono state scoperte per la prima volta come subunità di un tipo specifico di complesso dell'ubiquitina E3 ligasi, definita SCF, nome derivato dalle sue tre subunità: SKP1, cullina e proteina F-box. I complessi SCF, come altre ubiquitina ligasi, catalizzano il legame covalente dipendente da ATP di molecole di ubiquitina con proteina segante per la degradazione proteolitica. La funzione principale della proteina F-box del complesso SCF è di legare il substrato per la proteolisi mediata dall'ubiquitina. Comunque, analisi di mutanti di Arabidopsis hanno portato all'identificazione di una proteina F-box, TIR1 (transport inhibitor response 1) che pare essenziale per l'allungamento dell'ipocotile dipendente dall'auxina e per la formazione di radici laterali. TIR1 è un è un componente di uno specifico complesso ubiquitina ligasi E3, definito SCFTIR1, che è necessario per il segnale auxinico nelle cellule. L'omologo di SKP1 nel complesso SCFTIR1 in Arabidopsis è definito ASK1. La funzione dei complessi SCFTIR1 è di segnare i regolatori trascrizionali espressi in modo costitutivo di geni indotti dall'auxina con catene di proteine di ubiquitina, segnandoli quindi per la degradazione ad opera del proteasoma. In ogni modo, due famiglie di regolatori di trascrizione partecipano alla via di segnale auxinica

TIR1: i fattori di risposta alle auxine e le proteine AUX/IAA. I fattori di risposta all'auxina (ARF) sono proteine nucleari a vita breve che si legano in modo specifico agli elementi di risposta all'auxina (AuxRE) TGTCTC nel promotore di geni primari, o precoci, di risposta all'auxina. Il legame di ARF con AuxRE porta alla disattivazione o repressione della trascrizione genica dipendente dal particolare ARF coinvolto, il quale sembra essere presente sul promotore di geni precoci dell'auxina indipendentemente dallo status auxinico. Le proteine AUX/IAA sono importanti regolatori secondari dell'espressione genica indotta dall'auxina. Infatti, esse regolano la trascrizione genica indirettamente, legandosi alla proteina ARF legata al DNA. Se la ARF in questione è un attivatore di trascrizione l'effetto della proteina AUX/IAA sarà di reprimere la trascrizione. Al contrario se l'ARF legato all'AuxRE è un repressore di trascrizione, la proteina AUX/IAA funzionerà da attivatore. La corta via di segnale responsabile dell'espressione genica indotta dall'auxina ha inizio con il legame dell'auxina con la subunità TIR1 del complesso ubiquitina ligasi SCFTIR1. Il legame dell'auxina con TIR1 induce un cambiamento conformazionale in SCFTIR1 che aumenta la dimerizzazione con AUX/IAA e attiva l'attività E3 ligasi. Di conseguenza le proteine AUX/IAA sono rapidamente ubiquinate e idrolizzate tramite il proteasoma. Le proteine ARF, in assenza dei loro regolatori negativi, stimolano o reprimono l'espressione genica, secondo l'ARF. I geni di risposta all'auxina la cui espressione è insensibile agli inibitori della sintesi proteica e che implica l'attivazione di fattori di trascrizione preesistenti sono definiti geni di risposta primaria o geni precoci. In generali questi geni svolgono tre funzioni principali: 1) Fattori di trascrizione. Alcuni geni precoci c...