Biochemia-wejściówka-3 PDF

Preview

Summary

skrypt do lab 3 z biochemii...

Description

Biochemia ĆW 3. CHROMATOGRAFIA KOLUMNOWA NA ŻELU SEPHADEX G-75

1. Technika chromatografii kolumnowej (formowanie i równoważenie kolumny, nanoszenie próby, rozwijanie chromatogramu, regulacja przepływu rozpuszczalników). CHROMATOGRAFIA KOLUMNOWA – jedna z metod chromatograficznych, służąca do rozdzielania mieszanin.

Polega na wprowadzeniu mieszaniny na adsorbent (stałą fazę stacjonarną) umieszczony w cylindrycznej kolumnie i rozdzieleniu jej na składniki przy użyciu ciekłej fazy ruchomej, wprowadzanej z odpowiedniego zbiornika lub dolewanej bezpośrednio na kolumnę. Przepływ fazy ruchomej może być grawitacyjny lub wymuszony przez niewielkie nadciśnienie wprowadzanego eluentu (uzyskiwane na przykład za pomocą pompy perystaltycznej lub sprężonego gazu) lub przez niewielkie podciśnienie u wylotu kolumny (uzyskiwane na przykład za pomocą pompki wodnej). Składniki mieszaniny przemieszczają się ku dołowi z szybkością zależną od siły oddziaływań ich cząsteczek z adsorbentem. Siła tych oddziaływań zależy od budowy cząsteczek, dlatego poszczególne składniki przemieszczają się z różną szybkością i dzięki temu rozdzielone składniki można kolejno odbierać na dole kolumny. Odparowanie rozpuszczalnika z odpowiednich porcji wycieku (frakcji) pozwala na otrzymanie czystych składników mieszaniny. W zależności od wielkości kolumn i ilości rozdzielanego materiału chromatografia kolumnowa może być wykonywana w skali analitycznej, laboratoryjnej (półpreparatywnej, preparatywnej) i przemysłowej.

1. Układ chromatograficzny składa się z:  fazy nieruchomej  fazy ruchomej  mieszaniny rozdzielanych substancji

2. Chromatografia kolumnowa jest bardzo dobrą i wydajną techniką służącą do wydzielania i oczyszczania produktów naturalnych i syntetycznych. Mechanizm rozdziału jest identyczny z mechanizmem rozdziału w chromatografii cienkowarstwowej.  dzięki istnieniu różnic w sile oddziaływań międzycząsteczkowych dla różnych związków pomiędzy składnikami mieszaniny, a fazą ruchomą oraz składnikami mieszaniny a fazą stacjonarną. W roli fazy stacjonarnej można używać rozmaitych adsorbentów.  najczęściej w chemii organicznej stosowanym jest silikażel (bardzo silnie polarny)

3. Chromatografia jako metoda rozdzielania składników mieszanin różnych substancji jest bardzo szeroko stosowana w pracach biochemicznych. Rozdział chromatograficzny jest wynikiem zróżnicowanego powinowactwa poszczególnych składników mieszaniny do fazy stacjonarnej i ruchomej, w których ten proces zachodzi. Powinowactwo z kolei jest uzależnione od stopnia adsorpcji, wymiany jonów i rozpuszczalności związków w określonych warunkach rozdziału oraz masy cząsteczkowej związku. W praktyce w każdym procesie chromatograficznym współdziałają ze sobą przynajmniej dwa spośród tych zjawisk. W zależności od przewagi czynników działających różnicująco na rozdzielane substancje można wydzielić 4 zasadnicze metody chromatograficzne: chromatografię adsorpcyjną, jonowymienną, podziałową i sita molekularnego.

4. Chromatografia adsorpcyjna. Jest to najstarsza metoda chromatograficzna. Opiera się ona na zjawisku adsorpcji, czyli przechwytywaniu z roztworu cząsteczek różnych substancji i wiązania ich za pomocą słabych oddziaływań fizykochemicznych występujących na powierzchni adsorbenta. Powinowactwo rozdzielanych związków do adsorbenta jest funkcją ich budowy chemicznej, charakteru adsorbenta i stosowanych rozpuszczalników. 5. Adsorbentem jest nierozpuszczalna w stosowanym rozpuszczalniku substancja, nie reagująca z rozdzielanymi związkami, zazwyczaj uformowana w postaci kolumny w rurce szklanej lub plastikowej. Na szczycie kolumny, zrównoważonej rozpuszczalnikiem, umieszcza się mieszaninę związków rozpuszczonych we właściwym, zwykle niepolarnym rozpuszczalniku, i po wsiąknięciu przemywa następnymi porcjami tego samego rozpuszczalnika. Ponieważ różne związki wykazują różne powinowactwo do adsorbenta, w czasie przesuwania się roztworu po powierzchni jego cząstek następuje rozdzielenie mieszaniny na poszczególne składniki. 6. Ruchliwość chromatograficzna związków jest odwrotnie proporcjonalna do ich powinowactwa sorpcyjnego i dlatego substancje słabo adsorbujące się (o mniejszym powinowactwie) przesuną się na większą odległość niż substancje silnie adsorbowane (o większym powinowactwie). Przy rozdzielaniu substancji barwnych jest to widoczne bezpośrednio. Można wówczas zawartość kolumny wypchnąć z rurki, pociąć na warstwy odpowiadające poszczególnym związkom, wymyć odpowiednim rozpuszczalnikiem i oznaczyć ilościowo. Można także, w miarę rozwijania kolumny, zbierać frakcje określonej objętości wypływające z dolnego jej końca. Jakość rozdziału zależy w dużym stopniu od równomiernego wypełnienia kolumny adsorbentem.

7. Stosowane adsorbenty dzieli się na 3 grupy zależnie od ich zdolności sorpcyjnej, mianowicie na: 1) słabe – sacharoza, skrobia, celuloza, węglan sodowy, 2) średnie – węglan wapniowy, fosforan wapniowy, węglan magnezowy, tlenek magnezowy, 3) silne – krzemian magnezowy, tlenek glinowy, węgiel aktywowany. Kolumnę można wypełnić adsorbentem bądź na sucho, przez wsypywanie małych porcji i równomierne lekkie ubijanie, bądź na mokro, przez wlewanie zawiesiny adsorbenta w rozpuszczalniku. Najczęściej stosowane są rozpuszczalniki niepolarne lub o niskiej polarności, takie jak heksan, benzen, eter naftowy, cykloheksan, toluen, chloroform i różne alkohole. Uwaga! Toluen i benzen ze względu na działanie rakotwórcze stosuje się z największą ostrożnością. 7. Chromatografia adsorpcyjna ma zastosowanie przy rozdzielaniu licznych związków niepolarnych, takich jak tłuszcze, sterydy, karotenowce, chlorofile. Rozdział oparty na zjawisku adsorpcji towarzyszy także w pewnym stopniu innym metodom chromatograficznym.

8. Chromatografia jonowymienna. Jest to metoda stosowana do rozdzielania substancji o charakterze jonowym i polega na wymianie jonów między związkami rozdzielanymi zawartymi w mieszaninie i substancją wiążącą, czyli jonitem. Jako substancje wiążące stosowane są nierozpuszczalne żywice wielkocząsteczkowe, zawierające liczne grupy dysocjujące. Główne zastosowanie mają jonity syntetyczne, tzw. żywice, w których do wysoce spolimeryzowanych i rozgałęzionych węglowodorów wbudowane są liczne grupy funkcyjne zdolne do dysocjacji. Jako jonity mogą być stosowane między innymi pochodne celulozy i sefadeksu. W zależności od rodzaju zdolnych do dysocjacji grup funkcyjnych jonity dzielimy na kationity i anionity. Kationity dysocjują na ruchliwy kation i związany z nierozpuszczalną siecią anion, anionity zaś odwrotnie, na ruchliwy anion i związany z siecią kation. Oddysocjowane kationy (najczęściej H+ i Na+ ) i aniony (najczęściej OH– ) mogą być wymieniane na inne jony pochodzące z roztworu. W wyniku działania sił elektrostatycznych między jonami jonitu i jonami rozdzielanych związków następują reakcje wymiany. Zależnie od wypadkowego ładunku każdego z tych związków ich powiązanie z jonitem wykazuje różny stopień trwałości i dlatego mogą one być wymywane selektywnie z kolumny za pomocą roztworów o odpowiedniej sile jonowej. Na tej podstawie następuje rozfrakcjonowanie składników mieszaniny. Chromatografia sita molekularnego. Rozdział mieszaniny tą metodą opiera się na różnej szybkości migracji poszczególnych związków przez złoże utworzone z granulek żelu o porach określonej wielkości. Szybkość ta jest uzależniona od wielkości cząstek rozdzielanych związków. Najbardziej rozpowszechnionym preparatem do rozdziału tą metodą jest żel dekstranowy – Sephadex firmy Pharmacia, z którego po napęcznieniu formuje się kolumnę w

rurce szklanej. Żel ten zbudowany jest z łańcuchów α-D-glukozy połączonych między sobą mostkami poprzecznymi z epichlorohydryny.

2.4. Rozdział metodą kolumnowej chromatografii adsorpcyjnej W adsorpcyjnej chromatografii kolumnowej analizowane substancje w postaci roztworu są nanoszone na adsorbent wypełniający kolumnę. Wybór rozpuszczalnika zależy przede wszystkim od rozpuszczalności substancji chromatografowanych. Związek organiczny jest zawsze silniej adsorbowany z rozpuszczalnika niepolarnego niż polarnego – natomiast już zaadsorbowany będzie tym silniej wypierany im bardziej polarny jest dany rozpuszczalnik. Następnie, przemywając złoże (adsorbent w kolumnie) rozpuszczalnikiem, ROZWIJAMY CHROMATOGRAM, czyli dzielimy mieszaninę na grupy związków lub poszczególne związki chemiczne i wymywamy je (eluujemy) z kolumny, zbierając kolejne frakcje eluatu (rozpuszczalnika z eluującymi się związkami). Wymywanie można prowadzić jednym rozpuszczalnikiem lub mieszaniną o stałym składzie (elucja izokratyczna) lub kilkoma kolejno, albo mieszaniną rozpuszczalników o wzrastającej polarności (elucja gradientowa). Spływające z kolumny frakcje zbiera się oddzielnie. W ten sposób uzyskuje się rozdział badanej mieszaniny na składniki nieadsorbowane i adsorbowane coraz silniej przez adsorbent. Poszczególne frakcje odparowuje się i bada innymi metodami. Rozdzielając mieszaniny związków organicznych, a szczególnie substancji pochodzenia naturalnego, mimo wielu wskazówek, jakie można znaleźć w literaturze, zawsze wskazane jest wykonanie próby na wzorcach oznaczanych substancji a następnie próby z małą ilością materiału. Poza tym, jak w przypadku innych metod empirycznych, potrzebna jest zawsze pewna doza inwencji eksperymentatora. Niejednokrotnie selektywny rozdział składników mieszaniny udaje się bardzo dobrze dopiero po uzyskaniu pewnego doświadczenia. Zasadniczą częścią każdego zestawu do chromatografii kolumnowej jest kolumna ze szkła obojętnego, której wymiary są dostosowane do skali przeprowadzanego rozdziału. Najczęściej mieszczą one od 10 do 100 g adsorbentu, co wystarcza do adsorpcji od 0,1 do kilku gramów substancji. Dla przyspieszenia elucji stosuje się słabe ssanie (pompka wodna) lub słabe tłoczenie. Napełnianie kolumny adsorbentem można przeprowadzać na sucho i na mokro. W metodzie na sucho adsorbent wsypuje się małymi porcjami do kolumny i ubija pałeczką szklaną. Następnie przemywa się adsorbent rozpuszczalnikiem, w którym nanosi się badaną mieszaninę. Metoda na mokro polega na wprowadzaniu do kolumny zawiesiny adsorbentu w rozpuszczalniku użytym do rozpuszczania substancji. W obu metodach napełnianie należy wykonać tak, by złoże adsorbentu było jednorodne, pozbawione pęcherzyków powietrza i tak ułożone, by nie zmieniało objętości w czasie rozdziału. Powierzchnia adsorbentu powinna być stale pokryta płynem od chwili wprowadzenia pierwszych porcji rozpuszczalnika do zakończenia procesu. W przeciwnym razie złoże na kolumnie może łatwo wyschnąć, co uniemożliwia prowadzenie prawidłowej adsorpcji i może spowodować utlenianie się niektórych substancji.

3.4. Przygotowanie kolumny do rozdziału W kolbce stożkowej o pojemności 25 do 50 ml umieścić ok. 4 g żelu krzemionkowego (żelu nie należy ważyć, proszę czekać na wskazówki prowadzącego), zalać go taką ilością eteru naftowego, aby słup cieczy nad zawiesiną wynosił ok. 1 cm. Zawartość kolbki mieszać ruchem łagodnym tak, by usunąć pęcherzyki powietrza z zawiesiny. W kolumnie chromatograficznej umieścić na przegrodzie ze szkła 1 krążek bibuły filtracyjnej. Następnie przygotować naczynie na rozpuszczalnik z przemywania kolumny. Zawiesinę żelu krzemionkowego lekko wymieszać i wlać przez lejek do kolumny, unikając zbędnego napowietrzania. Wlać tyle zawiesiny, aby złoże adsorbentu po ułożeniu się w kolumnie miało wysokość ok. 6 cm. Po napełnieniu i ułożeniu adsorbentu w kolumnie na wierzch złoża nałożyć krążek bibuły, następnie przemyć zawartość kolumny 6 ml eteru naftowego ( lub więcej aż do osiągnięcia stałej wysokości złoża w kolumnie) i zamknąć wypływ z kolumny. Należy pamiętać, by warstwa adsorbentu była stale pokryta rozpuszczalnikiem!

3.5. Nanoszenie ekstraktu na kolumnę Jeśli ekstrakt był podgrzewany, należy go schłodzić do temperatury pokojowej. Wypuścić z kolumny nadmiar eteru naftowego tak, by wysokość cieczy nad złożem wynosiła 1-2 mm. Nanieść roztwór analizowany na czoło kolumny, wlewając go powoli pipetą lub strzykawką najlepiej po ściance kolumny tuż nad powierzchnią żelu. Od momentu naniesienia ekstraktu na kolumnę rozpoczyna się zbieranie frakcji. Gdy roztwór znajdzie się w złożu a wysokość cieczy nad złożem wyniesie ok. 1-2 mm, wlać ostrożnie po ściance kolumny 1 ml eteru naftowego i odczekać jak poprzednio (można przyspieszyć przepływ fazy ruchomej, stosując lekkie nadciśnienie). Czynność tę powtórzyć jeszcze raz, używając następną, 1 ml porcję eteru naftowego. Gdy składniki ekstraktu są zaadsorbowane na złożu, można dodać pozostałą objętość eteru naftowego, wynikającą z rozmiarów złoża i warunków rozdziału podanych poniżej i prowadzić wymywanie frakcji węglowodorów alifatycznych i WWA.

2. Sączenie molekularne: charakterystyka żeli typu Sephadex, inne rodzaje żeli filtracyjnych m.in. Sepharose, Sephacryl, mechanizm sączenia molekularnego, pojęcia charakteryzujące stosowaną w doświadczeniu kolumnę chromatograficzną oraz zachowanie się rozdzielanych związków (Vt, V0, Vi, Vg, Ve, Kd, Kav), zastosowanie metody sączenia molekularnego. 1. Charakterystyka żeli typu SEPHADEX Chromatografia na żelu Sephadex, określana też jako sączenie molekularne, jest techniką umożliwiającą analityczny bądź preparatywny rozdział substancji różniących się masą cząsteczkową. Sephadex jest handlową nazwą preparatu uzyskiwanego przez wytworzenie wiązań poprzecznych pomiędzy łańcuchami dekstranu. Preparaty żelu, mające postać granulek o średnicy 10-300 µm w zależności od stopnia usieciowania, różnią się zdolnością wchłaniania wody, co służy za kryterium ich podziału i decyduje o rozdzielczych właściwościach żelu. 2. Charakterystyka żelu SEPHAROSE Sepharose jest żelem agarozy o sferycznych ziarnach. W handlowej postaci występuje jako białkowa zawiesina w wodzie, która zawiera 0,02% azydek sodu jako czynnik bakteriostatyczny. Najczęściej stosowaną jest Sepharose 4B. Wraz ze wzrostem stężenia agarozy zmniejsza się jej porowatości, co z kolei powoduje zwiększenie sztywności. Sepharose rozpuszcza się po podgrzewaniu do 40°C, a także może zostać zniszczony pod wpływem zamrażania. Sepharose jest stabilna w wodnych (w tym o wysokim stężeniu soli) roztworach w zakresie pH od 4 do 9. 3. Charakterystyka żelu SEPHACRYL Całkowicie syntetyczne sito molekularne-kopolimer allilodekstranu i N,N’- metylenobisakrylamidu 2.1 Mechanizm sączenie Separacja makrocząsteczek przy zastosowaniu techniki filtracji żelowej polega na: wykorzystaniu porowatej struktury ziaren żelu oraz zjawiska dyfuzji, któremu podlegają zarówno molekuły solwentu, jak i separowane makromolekuły. Duże cząsteczki takie jak np. Blue Dextran, które są większe niż pory napęczniałych ziaren żelu nie mogą penetrować do ich wnętrza, a więc przechodzą wyłącznie poprzez fazę wodną złoża i są eluowane jako pierwsze. Mniejsze cząsteczki z kolei wnikają w rożnym stopniu do wnętrza ziaren (w zależności od swego kształtu i rozmiaru) i są eluowane w kolejności

zmniejszania się ich masy cząsteczkowej (tj. w pierwszej kolejności eluowane będą cząsteczki o największej masie/kształcie/rozmiarze, następnie średnim a na końcu najmniejszym).

2.3. Pojęcia charakteryzujące stosowaną w doświadczeniu kolumnę chromatograficzną Charakteryzując kolumnę chromatograficzną oraz zachowanie się rozdzielonych substancji, stosuje się następujące pojęcia: ➢ objętość swobodna (zerowa) (V0) – objętość rozpuszczalnika znajdującego się pomiędzy ziarnami żelu ➢ objętość wewnętrzna (Vi) - objętość rozpuszczalnika wypełniającego ziarna żelu ➢ objętość matrycy żelu (Vg) ➢ objętość całkowita złoża (Vt) Vt= V0+Vi+Vg ➢ objętość elucyjna (Ve), charakterystyczna dla danej substancji.

Rozpatrując sączenie molekularne na żelu jako szczególny przypadek chromatografii podziałowej, stosujemy zależność pomiędzy objętością elucyjną substancji (Ve) a charakterystycznym dla danej substancji współczynnikiem podziału między fazę stacjonarną i ruchomą: Ve = V0 + Kd Vi

gdzie:   

Kd - współczynnik podziału, V0 - faza ruchoma Vi - faza stacjonarna

W chromatografii na żelu stosuje się dwa różne współczynniki podziału, w zależności od zdefiniowania fazy stacjonarnej. Jeżeli jako fazę stacjonarną traktuje się rozpuszczalnik związany z żelem /Vi/ uzyskujemy zależność: Kd = Ve – V0/Vi W praktyce trudno jednak ustalić Vi, w związku z tym jako fazę stacjonarną przyjmujemy całą fazę żelową tzn: (Vi+Vg): Kav= (Ve – V0)/ (Vt -V0) Wartość Kav (współczynnik dostępności) jest łatwiejsza do wyznaczenia, stąd też częściej jest stosowana w praktyce.

2.4 Zastosowanie metody sączenia molekularnego W pracy laboratoryjnej sączenie molekularne wykorzystuje się do: ➢ rozdziału substancji różniących się masą cząsteczkową, ➢ odsalania substancji wielkocząsteczkowych, ➢ wyznaczania ciężaru cząsteczkowego związków.

3.Budowa związków rozdzielanych na żelu Sephadex G-75 (Blue Dextran, cytochrom c, dwuchromian potasu). Chromatografia cieczowa na żelu Sephadex, określana też jako sączenie molekularne, jest techniką umożliwiającą analityczny bądź preparatywny rozdział substancji różniących się masą cząsteczkową.  Blue Dextran - polisacharyd, do którego kowalencyjnie przyłączono molekuły barwnika Cibaron Blue. Blue Dextran jest polimerem glukozy o wysokiej masie cząsteczkowej zawierającym kowalencyjnie związany barwnik Reactive Blue 2. Ten niebieski barwnik jest znany z wysokiego powinowactwa wiązania z szeroką gamą białek, ze szczególnie wysokim powinowactwem do albuminy w surowicy.  Cytochrom c- ma w swojej budowie niewielką resztę białkową złożoną ze 140 aminokwasów. Do cystein reszty białkowej dołączona jest wiązaniami kowalencyjnymi reszta hemowa za pośrednictwem reszt winylowych. Ponadto, atom żelaza jest połączony wiązaniem koordynacyjnym z resztą histydyny i siarką reszty metioninowej. 



Dichromian potasu -to sól potasowa, która jest solą dipotasową kwasu dichromowego . Ma rolę utleniacza, alergenu i sensybilizatora. Zawiera dichromian (2-)

3. Inne rodzaje metod chromatograficznych (chromatografia jonowymienna, powinowactwa, oddziaływań hydrofobowych i fazy odwróconej): mechanizm oraz zalety i ograniczenia każdej z chromatografii

1.Chromatografia jonowymienna -> ładunek ( chromatografia adsorpcyjna)

Faza stacjonarna – matryca chemiczna zmodyfikowanego polisacharydu o wypadkowym ładunku dodatnim ( ANONIT) lub ujemnym (KATIONIT -bo wiążą kationy)  Chromatografia jonowymienna stosowana jest: do rozdziału związków na podstawie różnicy ich ładunku elektrycznego. Metoda ta pozwala rozdzielić związki o niewielkiej różnicy ładunku i nie powoduje denaturacji białka.  Na czym to polega? Kolumnę chromatograficzną wypełnia się złożem posiadającym ładunek dodatni (wymieniacz anionów -anionit) lub ujemny (wymieniacz kationów -kationit). 

Rozdział białek na kolumnie jonowymiennej następuje na podstawie odwracalnej adsorpcji białek na kolumnie.- Białko, którego wypadkowy ładunek w obojętnym pH jest dodatni, będzie się wiązać z wymieniaczem jonowym poprzez jego grupy karboksylowe (z kationitem). Nie związane z kolumną związki (np. białka o ładunku ujemnym) zostaną wypłukane. Związane białka o ładunku dodatnim wymywa się z kolumny np. buforem o zwiększającym się stężeniu chlorku sodu. Jony sodowe współzawodniczą z dodatnimi grupami białka o miejsca wiązania na złożu wypełniającym kolumnę. Jako pierwsze z kolumny będą wypływać białka o małej gęstości grup dodatnich natomiast białka o większej gęstości ładunków pojawia się później.

Wielkość ładunku białka w roztworze zależy od jego punktu izoelektrycznego (takie pH w którym białko ma ładunek sumaryczny równy zeru) oraz od pH roztworu. Białko w buforach o pH powyżej swojego punktu izoelektrycznego będzie posiadać ładunek ujemny i będzie wiązane przez anionity, natomiast w buforach o pH poniżej swojego punktu izoelektrycznego będzie posiadać ładunek dodatni i będzie wiązane przez kationity. Dlatego do rozdziału tego samego białka można używać zarówno anionitów i kationitów. Wybór rozdziału będzie zatem zależał od punktu izoelektrycznego białka i jego stabilności w danym pH.

Zastosowanie: rozdzielanie i oznaczanie nieorganicznych, albo organicznych kationów, albo/i anionów, w t...