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Camargo Peña Zaira Liliana 4QM De Lira Huicochea Fatima SECCION 2INTRODUCCIÓNLos plásmidos son moléculas pequeñas de ADN circular capaces de replicarse de forma autónoma, independientemente del cromosoma. Son muy comunes en bacterias y algunos de ellos, los más pequeños, existen en las células bacte...

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Camargo Peña Zaira Liliana De Lira Huicochea Fatima

4QM1 SECCION 2

AISLAMIENT AISLAMIENTO O DE DNA PLASMÍDI PLASMÍDICO CO

INTRODUCCIÓN Los plásmidos son moléculas pequeñas de ADN circular capaces de replicarse de forma autónoma, independientemente del cromosoma. Son muy comunes en bacterias y algunos de ellos, los más pequeños, existen en las células bacterianas en un número elevado (hasta 100 copias por célula). Los plásmidos son una herramienta fundamental, ya que se pueden usar como “vectores” para introducir en ellos cualquier fragmento de ADN de interés y de esta forma amplificarlo de forma natural dentro de la bacteria en la que el plásmido se replica (es lo que se llama “clonar” un fragmento de DNA). Existen muchos plásmidos disponibles para usar con este fin y la mayoría contienen al menos los siguientes elementos:

fluoresce cuando está unido a él. Al iluminar el gel con luz UV se ven bandas de fluorescencia que corresponden a moléculas de ADN.

OBJETIVOS:  

Aislar y purificar el plásmido pUC19 de Escherichia coli. Realizar electroforesis en gen DNA del de agarosa del plásmido obtenido.

RESULTADOS:

-Un origen de replicación autónomo para E. coli (ej. ColE1) que permite la replicación autónoma en esta bacteria. -Un gen que confiere a la bacteria portadora del plásmido resistencia a algún antibiótico, generalmente ampicilina. -Un sitio de clonación múltiple en el que se encuentra dianas únicas para varias enzimas de restricción y que permite la introducción del ADN a clonar. Un método que permite visualizar ADN plasmídico o fragmentos del mismo es la electroforesis en gel de agarosa, en la cual se separan en función de su tamaño. Esta técnica consiste en someter la mezcla de moléculas de ADN embebidas en un gel de agarosa a un campo eléctrico. Las moléculas de ADN son atraídas al polo positivo debido a la carga neta negativa de ambas cadenas consecuencia de sus grupos fosfato. Las moléculas más pequeñas migran más rápido que las grandes al verse menos “frenadas” por el gel de agarosa en su desplazamiento. Cuando los fragmentos se han separado, el gel se sumerge en una solución que contiene bromuro de etidio y luego se ilumina con luz UV. El bromuro de etidio (EtBr) es una molécula plana con afinidad por el ADN que se intercala entre las pares de bases y que tiene la particularidad de que

Imagen 1. Corrimiento de DNA plasmídico en un soporte de agarosa.

DISCUSIÓN: En la práctica, para la obtención de DNA plasmídico, se realizó por medio de bacterias crecidas en un medio de luria-ampicilina en un tiempo aproximado de 24 horas de Escherichia Coli, en esta se encuentra el plásmido más representativo pUC 19 que lleva un origen de replicación y el gen de resistencia a la ampicilina. Se centrifugó 1.5 mL del crecimiento bacteriano en un tubo eppendorf a 13000 rpm durante 5 minutos, y se desechó el sobrenadante. Posterior a esto se agregó la solución 1 (glucosa, EDTA y Tris) al precipitado, donde el Tris lo solubiliza y da las condiciones, la glucosa le proporciona una

Camargo Peña Zaira Liliana De Lira Huicochea Fatima densidad adecuada (gradiente) y por último el EDTA protege al DNA al no permitir que lo ataquen las nucleasas (enzimas que actúan sobre los ácidos nucleicos), cuales tienen como cofactor al Mg+2, ya que este atrapa iones por sus cargas formando un complejo con el cofactor impidiendo que realicen su función. Se incuba en hielo para reducir la actividad enzimática. Después se agrega la solución 2, donde el SDS al 1% junto con el NaOH (soluciónisotónica) disuelve la membrana (fosfolípidos) liberando el material de la célula. Se agregó la solución 3, formada de acetato de potasio (pH= 4.8), que precipita al SDS junto con otras macromoléculas del medio, pues al haber un cambio drástico en el pH algunas macromoléculas se desnaturalizan, como el DNAcromosomal, la cual queda en el precipitado, mientras que el DNA plasmídico se queda en el sobrenadante junto con el RNA al realizarse la centrifugación durante 5 minutos a 13000 rpm. De inmediato el sobrenadante (que contiene al plásmido) se le adicionó la solución IV, la cual contiene isopropanol, que provoca la deshidratación del DNA y su precipitación. En seguida se centrifugó y se secó al aire. Se adicionó la solución V, la cual contiene Tris-EDTA. Como se mencionó antes, el Tris da un medio estable al DNA, mientras que el EDTA lo protege de la acción las nucleasas. Después de su obtención, se comprobó su aislamiento a través del recorrido de DNA en el gel de agarosa con azul de bromofenol, este puede tener 3 isoformas (superenrrollado, lineal y circular), esto dependerá del tratamiento de la muestra. En el extremo inferior de la imagen 1 se observa el corrimiento de DNA. Se pueden observar los fragmentos de RNA, los cuales viajan más rápido atravesando la malla que crea la agarosa. De manera ascendente se puede observar la zona perteneciente a el DNA plasmídico y en el extremo superior se encuentra la zona de aplicación junto con fragmentos de DNA cromosómico. Como revelador, se utiliza bromuro de etidio, ya que este emite florescencia en presencia de luz ultra violeta, aprovechando las propiedades de irradiación que genera con el DNA. El corrimiento de DNA plasmídico que obtuvimos fue el señalado con la flecha, donde en comparación con otros equipos se observa una mayor cantidad de RNA, después de DNA con estructura súper enrollada,

4QM1 SECCION 2 seguida de la estructura lineal y por último la circular. La estructura súper enrollada viaja más rápido a través del soporte de agarosa ya que se mantiene intacta su estructura. La estructura lineal de DNA se debe a que una hebra del ADN se rompió haciendo que su recorrido sea más lento que el anterior mencionado y por último la estructura relajada corresponde a que el DNA se quedó muy dañado y se fragmenta ocasionando que su recorrido sea más lento que las otras dos estructuras. A si mismo se observa que hay una menor cantidad de DNA cromosomal.

CONCLUSIONES: 



Se comprobó el aislamiento del DNA plasmidíco de pUC19 de Escherichia coli por medio del recorrido de DNA en gel agarosa utilizando bromuro de etidio. La isoforma del DNA plasmidico que se presentó en mayor cantidad fue la de estructura superenrollada.

BIBLIOGRAFÍA: 

Feduchi Canosa, Elena (et all). “Bioquímica: conceptos esenciales”. Editorial médica panamericana. Pp 283-284 (2010)...