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BITACORA DE PRACTICAS DE MICROBIOLOGÍA...

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UNIVERSIDAD DE SONORA DIVISIÓN DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Y DE LA SALUD CAMPUS CAJEME LICENCIATURA EN MEDICINA

BITACORA VIRTUAL DE MICROBIOLOGÍA LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA

TITULAR DE LA MATERIAL: JAEL TERESA DE JESÚS QUINTERO VARGAS

ELIZALDE MORÁN JAZMÍN FRAIJO CORRAL LILIA AMAIRANY GÓMEZ ALCANTAR JOSSUÉ RADAMÉS MIRANDA QUINTANA JONATHAN LEONEL VALENZUELA MORALES ERICK FERNANDO

DICIEMBRE DEL 2017.

CD.OBREGÓN, SONORA.

Práctica 1: El uso del microscopio óptico Objetivos Analizar el microscopio y determinar sus partes, para después ver el modo de uso del mismo.

Introducción La microscopia óptica, las preparaciones histológicas son estudiadas mediante la luz que atraviesa el tejido. El microscopio óptico está constituido por partes mecánicas y otras ópticas. El componente óptico está formado por tres sistemas de lentes: condensador, objetivo y ocular El condensador concentra la luz y proyecta un haz luminoso sobre la muestra. El objetivo proyecta una imagen aumentada del objeto hacia el ocular; finamente, el ocular amplía todavía más la imagen y la proyecta en la retina, en un negativo fotográfico o en un detector. En lo que se refiere a las imágenes proyectadas en la retina, la amplificación total ofrecida por el microscopio óptico es igual al aumento producido por el objetivo multiplicado por el aumento proporcionado por el ocular. El factor más importante para que el microscopio pueda ofrecer una imagen detallada de su poder de resolución, que se define como la distancia menor entre dos partículas o líneas que todavía permiten que sean visualizadas como dos objetos distintos. La propiedad del aumento solo tiene valor práctico cuando se acompaña de un poder de resolución adecuado. Los límites de la microscopia óptica han sido ampliados por el uso de cámaras de video de alta sensibilidad y de gran resolución que permiten la digitalización de imágenes para su uso de ordenadores y para el estudio cuantitativo mediante técnica de análisis de imágenes. Estas tecnologías nos permiten observar detalladamente estructuras morfológicas más a detalle, ya sea para identificarlas o para el aprendizaje de esta misma. 1

Materiales y reactivos  

Microscopio óptico Laminilla con microrganismos.

Metodología

Recibimos el microscopio con suavidad y sujetándolo fuertemente con ambas manos y lo colocamos gentilmente sobre la mesa, limpiamos las partes mecánicas y los lentes. Limpiamos cada uno de los lentes e identificamos cada uno de los componentes del microscopio, y por último calculamos el total de amplificación de los diferentes objetivos así mismo como el aumento útil de los diferentes objetivos.

Resultados

Objetivo 100x

Objetivo 100x

Objetivo 100x

Objetivo 100x

Discusión de resultados La observación fue fácil, porque la mayoría de nuestros compañeros ya sabían cómo utilizar un microscopio.

Conclusión Se realizó una práctica fácil pero importante en la que se necesitó de los conocimientos de todos los del equipo e incluso de la profesora, vimos muestras teñidas de microrganismo e intentamos identificarlas. Por último, se tomó el microscopio y se guardó.

Actividades 1. ¿Cuál es la importancia del uso del microscopio en el laboratorio de microbiología experimental? El uso del microscopio es importante para la observación de microorganismos como las bacterias que no son visibles a simple vista, logrando así el poder analizar, distinguir su estructura y diferencias entre distintos microrganismos.

2. ¿Cuál es la principal diferencia entre un microscopio electrónico (sem/tem) y un microscopio óptico? 2

3. 4.

¿La preparación de una muestra para ser observada es igual a la SEM o TEM? En el microscopio óptico la preparación de la muestra es mediante tinciones que resultan muy sencillas, mientras que en el microscopio electrónico las preparaciones son barridos las cuales son muy complejos a comparación de las tinciones Los microscopios electrónicos de transmisión (TEM del inglés transmission electron microscopes) hacen pasar electrones a través de un espécimen delgado y pueden revelar los detalles de la estructura celular interna, incluidos los organelos y las membranas plasmáticas. Los microscopios electrónicos de barrido ( SEM del inglés scanning electron microscopes) rebotan electrones en especímenes que se han recubierto con metales y ofrecen imágenes tridimensionales. Estos SEM permiten observar los detalles superficiales de estructuras cuyo tamaño varía desde insectos enteros hasta células e incluso organelos o compartimentos subcelulares.3

5. ¿Cuál crees que sean los errores más comunes que cometen los alumnos en clase al manipular el microscopio? Mal uso de los objetivos, no saber usar el aceite de inmersión en el objetivo 100x, no tomar del brazo y la base al microscopio al momento de guardarlo o tomarlo.

Referencias bibliográficas 1. Junqueira Luis carneiro José (2005) histología básica. España: Elsevier Masson 2. Http://ctaetis.blogspot.mx/p/nuestro-m-micro/ 3. http://www.acercaciencia.com/2014/10/17/de-ojos-lupas-y-microscopios/

Practica 2: Métodos para observar evidencia directa de microrganismos Objetivo Familiarizarse con las morfologías de microrganismo en preparaciones liquidas directas de muestras biológicas, en este caso orina, esputo, Klebsiella y Echerichia Coli.

Introducción Una característica muy importante de las bacterias es su respuesta a la tinción Gram. la propiedad de tinción Gram parece ser fundamental, debido a que la relación que implica tiene mucha correlación con muchas propiedades morfológicas en formas con filogenia relacionada, microrganismo que tiene potencial a ser Gram positivo podría parecerlo solo bajo una serie de condiciones ambientales particular y en cultivo joven. Este método adquirió su nombre a partir del histólogo Hans Christian Gram con el objetivo de identificar bacterias de tejidos infectados. La base de la reacción diferencial de Gram es la estructura de la pared celular. 1

Este procedimiento produce una acción mordiente en la que la forman complejos morados insolubles con proteínas ribo nucleares dentro de la célula, la diferencia entre las bacterias Gram positivas y las Gram negativas se encuentra en la permeabilidad de la pared celular ante estos complejos, al tratarse con mezclas de solventes de alcohol y acetona, esto extrae os complejos morados de la tinción de yodo de las células Gram negativas, mientras las bacterias Gram positivas las retienen. En muchas infecciones bacterianas, los agentes etiológicos pueden verse con facilidad en frotis de pus o líquidos con tinción de Gram. Las bacterias moradas o rojas se observan contra un fondo Gram negativo de leucocitos, exudado y sedimento. 2

Metodología Se hará una tinción Gram primero hay que lavar el portaobjetos y flamearlo, después se va a flamear el asa redonda para esterilizarla, una vez templada se toma solución salina y la muestra problema (las cuales fueron orina, esputo, Klebsiella y Echerichia Coli) y expandirlos por el portaobjetos (1cm 3). Luego dejamos secar la extensión al aire cerca del fuego para crear un campo estéril (directamente sobre el fuego no, para no contaminar), ya estando seca , se flamea solo un poco para fijar , luego hicimos la tinción de la siguiente manera: primero pusimos cristal violeta y lo dejamos reposar durante 1 min, lavamos cuidadosamente dejando caer el chorro de agua sobre el dorso de la mano para que esta cayera de manera indirecta y gentil sobre la muestra, después pusimos Lugol por otro minuto, lavamos de manera suave y decoloramos con alcohol – acetona por 10-15 segundos y volvimos a lavar, por último, agregamos safranina otro minuto y lavamos, secamos la muestra al aire y observamos desde 4x hasta 100x(aceite inmersión).

Resultados

Esputo, objetivo 100x Orina, objetivo 100x

Echerichia coli, objetivo 100x

Discusión de resultados La práctica fue fácil, solo hubo un problema, fue al realizar el frotis, la muestra no fue distribuida bien y al observar al microscopio no se observaba una imagen clara.

Conclusión Se llevó a cabo una práctica que se necesitó el conocimiento de nuestros compañeros y con ayuda de la doctora Jael se realizaron frotis con muestras de orina y esputo, las cuales fueron teñidas con tinción Gram, además se tiñeron muestras de Klebsiella y Echerichia coli. Se observaron al microscopio para ver si resultaron Gram positivas o Gram negativas.

Actividades 1. ¿Porque es conveniente realizar una capa fina al momento de hacer el frotis de microrganismos a estudiar? Porque el objetivo del frotis es deparar lo más posible los organismos, ya que si aparecen agrupados en la preparación es muy difícil obtener una imagen clara y nítida, una capa fina de frotis nos permite nos permite obtener una imagen clara y nítida. Alterando lo menos posible la morfología y las posibles agrupaciones de células que pudiera haber, en cambio en un frotis grueso tendríamos los microrganismos agrupados y no obtendríamos una buena imagen.3 2. ¿Cuál es la ventaja que ofrece el aceite de inmersión, respecto a la observación respecto a la observación con los objetivos secos? ¿qué diferencia existe entre ellos? El aceite de inmersión tiene aproximadamente el mismo índice de refracción que el vidrio (1,5 aprox.) y con él se eliminan cadi completamente los rayos de la luz y aumenta en gran cantidad la eficacia del uso del microorganismo. Al ofrecer un índice de refracción similar al del vidrio, el objeto aparece como “incluido en el vidrio del objetivo” eliminando el efecto reflector del vidrio exterior del portaobjeto. Esto permite lograr mayores aumentos con menor distorsión esférica, menor aberración cromática y mayor luminosidad o “abertura de pupila”.4 3. Explique el fundamento de la tinción Gram. Los lavados con agua tienen el objetivo de arrastrar mecánicamente el exceso de colorante y quitar el alcohol-acetona. El colorante cristal violeta es de naturaleza básica y por lo tanto tiene afinidad por sustancias cargadas negativamente como la pared celular de cualquier bacteria. Por lo que bacterias Gram positivas y Gram negativas son teñidas de color violeta. Un mordiente es una sustancia que aumenta la fijación de algún colorante sobre una superficie determinada, en este caso el cristal violeta aumenta su

fijación a la pared celular bacteriana usando de mordiente al Lugol, en la pared bacteriana el Lugol forma un complejo con el cristal violeta insoluble en agua lo que evita que se disuelva y se pierda el colorante durante el enjuague. Ya sabemos que las paredes de los Gram positivos son ricos en ácidos teicoicos no saturados estos muestran gran afinidad por los agentes oxidantes, todos los mordientes por ejemplo el Lugol son agentes oxidantes y su efecto en general consiste en dar un carácter de más acidez de los ácidos teicoicos lo que aumenta la afinidad de estos por el colorante básico cristal violeta. La mezcla de alcohol-acetona es un disolvente orgánico que decolora la pared bacteriana disolviendo el complejo cristal violeta-Lugol, esta decoloración no afecta a las bacterias Gram positivas, hay varias explicaciones al respecto, les menciono las dos más aceptadas. Una teoría dice: El alcohol-acetona, deshidrata la pared rica en peptidoglicano de los microorganismos Gram positivos lo cual cierra los poros de la pared, propiciando una barrera que no permite la salida del complejo cristal violeta-Lugol. En la pared de las bacterias gramnegativos hay poco péptido glicano y una gran cantidad de lípidos estos últimos son disueltos por el alcohol-acetona, lo que permite el escape del complejo cristal violeta-Lugol. Otra teoría dice: Las bacterias Gram positivas tienen una capa muy gruesa de peptidoglicano con gran cantidad de enlaces entrecruzados de ácidos teicoicos los cuales son poco solubles en alcohol-acetona formando una especie de barrera en la pared bacteriana que no permite la salida del complejo cristal violeta-Lugol por ende se retiene el cristal violeta-Lugol en la pared en el proceso de decoloración. La safranina es un colorante catiónico que tiñe las paredes bacterianas ya que estas tienen compuestos cargados negativamente, por consiguiente, las bacterias Gram negativas se tiñen de color rosa, sin embargo, las bacterias Gram positivas no se tiñen debido a que su pared celular está saturada del colorante cristal violeta y esto no permite la entrada de la safranina.5 4. Explique la utilidad de la tinción Gram En el análisis de nuestras clínicas suele ser un estudio fundamental por cumplir varias funciones: identificación preliminar de la bacteria causal de una infección. Utilidad como control de calidad del aislamiento bacteriano. 6 5. Investigue el género y especie de 5 bacterias Gram positivas y 5 Gram negativas, mencione la enfermedad que causa cada una de ellas y a que antibióticos es sensible. Gram positivas Bacillus anthracis: carbunco cutáneo, sensible a ciprofloxacina o ooxicilina.7 Listeria monocytogenes, listeriosis, sensible a ampicilina.8

Staphylococcus aureus, infecciones cutáneas, neumonía, sensible a cefalosporina oxacilina.9 Clostridium botulinum: botulismo, sensible a ningún antibiótico, se necesita antitoxina. 10 Streptocossu agalacteae, meningitis, sensible a penicilina y ampicilina.11 Gram negativas Helicobacter pylori, gastritis, ulcera péptica, sensible a omeprazol.12 Neisseria gonorrhoeae, gonorrea, sensible a ceftriaxona o penicilina.13 Neisseria meningitis, meningocemia, sensible a cefalosorinas.14 Haemophilus influenzae, epiglotitis, sensible a ceftriaxona.15 Proteus mirabilis, proteus, sensible a ceftriaxona.16

Referencias bibliográficas 1.Geo F. Brooks, Karen C. Carol, Janet S. Butel. (2008). Microbiología médica de Jowert, Melnick y Adelberg. México: Manual moderno. 2. Kenneth j. Ryan, C. George Ray. (2011). MICROBIOLOGÍA MÉDICA. México, D: Mc Grow Hill. 3. Gram C. (1984). The differential of shizomycetes in tissue sections and dried preparations. Forstchritte der Medizin, 2, 185-9. 4. Aulton Michael E. (2004): Ciencia y diseño de formas farmacéuticas. España: Elsevier, 2° EDICIÓN. 5. Bergey, David H., Holt, Jhon G., Krieg, Noel R., Sneath, Peter H.A. (1994): Bergey’s manual of determinative bacteriology. Lippincott Williams & Wilkins, 9° ED. 6. Madigan, M.T; Martinko J., Parker J. (2004): Brock Biology of microorganisms. Lippincott & Wilkins. 10° Ed. 7. Carrada Bravo, Teodoro. > (PDF) 2015.

8. Lorber B. Listeria monocytogenes. In: Bennett JE, Dolin R, Blaser MJ, eds. Principles and practice infectious diseases. 8th ed.2015 ELSEVIER 9. Hurtado, MP; de la Parte, MA; Brito A (2002). >. 10. Arnon SS. Botulism (Clostridium botulinum). In: Klegman RM, Stanton BF, St. Geme, Schor NF, eds. Nelson textbook of pedriatics. 20th ed. 11. Whiley RA, Hardie JM (2009). Genus I. Streptococcus Rosanbach 1884. Bergey’s manual of systematic bacteriology; Vol 3: 2nd Ed. 12.Blaser MJ (2005), An endangered species in the stomach. Scientific American 292. 13. Conde-González, Carlos; Uribe-Salas, Felipe (1997) Gónorrea: La prespectiva clásica y actual. Salud Publica Méx. Cuernavaca. 14. Fernandez Viladrich P. y Pérez Trallero E. “ Infección meningocócica” 2015 Madrid. 15. Asociación Española de Pediatría, 2008. 16. Frénod, Emmanuel (2006). 697-720.

Práctica 3: Tinciones selectivas observación de capsulas Objetivos Que el alumno observe estructuras bacterianas especiales, como las endosporas y capsulas a través de tinciones selectivas.

Introducción Las bacterias se pueden clasificar según su aspecto macroscópico, por el crecimiento y las propiedades metabólicas características, por su antigenicidad y, por último, por su genotipo. Las capsulas y la capa de limo se conoce también se conocen como glucogalix, una excepción a esta regla es Bacillus authrocis que produce una capa polipéptica, aunque la capsula apenas es visible al microscopio, puede visualizarse por la exclusión de partículas de tinta china.

Aunque las capsulas y las capas de limo son innecesarias para el crecimiento de las bacterias, revisten una gran importancia para su supervivencia en el organismo anfitrión. La capsula es poco antígena y antifagocitica, además, constituye un factor de virulencia significativo, la capsula puede actuar como barrera frente a moléculas hidrófobas toxicas (por ejemplo): detergentes), así como facilitar la adherencia a otras bacterias o a las superficies de los tejidos del anfitrión. La distinción inicial entre las bacterias se puede realizar en función de las características de crecimiento en distintos nutrientes y medios de cultivo selectivos. La forma de las células es variable en los tejidos teñidos con tinta china: esférica, ovalada, o elíptica; suelen rodearse de zonas esféricas o de contorno liso y fácil visualización que representan la capsula polisacárida extracelular. La capsula es un marcador inconfundible cuyo diámetro puede ser hasta 5 veces mayor que el de la célula micótica, se detecta con facilidad mediante uan tinción de mucina como la técnica de Mucicarmin de Mayer. Un ejemplo seria la modificación del procedimiento de KOH, en el cual se agrega tinta china como material de contraste. El pigmento se utiliza principalmente para detectar especies de cryptococcus en el LCR y en otros líquidos corporales. La capsula polisacarida de las seis especies de cryptococcus no se tiñe, creando un halo alrededor de la célula de levadura.1

Metodología Primero que nada, realizamos la tinción de Gram para luego compararla con la tinción negativa. Llevamos a cabo el procedimiento de la tinción Gram al pie de la letra, luego procedemos a realizar la tinción negativa, primero colocamos un poco de tinta negra en un portaobjetos, luego le introducimos Klebsiela sp y mezclamos con cuidado con un asa estéril, pasamos a realizar la extensión del frotis con un segundo portaobjetos, o dejamos secar cerca del mechero y pasamos a observar en el microscopio en el objetivo 100x con aceite de inmersión.

Resultados

Klebsiella, tinción negativa con tinta china objetivo 100x

Klebsiella, tinción Gram, objetivo 100x

Discusión de resultados Las dos tinciones nos salieron muy bien ya que se alcanzaron a ver muy bien las bacterias, en la tinción Gram se alcanzó a ver una coloración Gram positiva, en la tinta china, el primer intento resulto fallido ya que uno de los integrantes se confió de haber practicado muchas veces el barrido del frotis, no lo hizo bien y lo volvimos a intentar y esta vez lo hicimos con más cuidado y salió un barrido mucho más uniforme y al momento de ver en el microscopio se vio muy bien la tinción y las paredes celulares y al apagar la luz se apreció más. La profesora al revisar nuestras tinciones dijo que estaban bien hechas y concluimos que hicimos un buen trabajo.

Conclusión Se llevó a cabo una práctica sumamente fácil la cual se realizó con nuestros conocimientos previos sobre tinción. Se hicieron dos tinciones, una tinción Gram y una tinción negativa con muestras de Klebsiella otorgadas por la doctora, se realizó una comparación de las tinciones bajo el microscopio y observamos las capsulas en la tinción negativa

Actividades 1. Mencione 5 ejemplos de bacterias encapsuladas y si cusan alguna enfermedad

Streptococcus pyogenes-faringitis estreptocogica Staphylococcus aureus-forunculos,menungitis Haemophilus influenzae-meningitis aguda Streptococcus pneumoniae-neumonia Kebsiella pneumoniae-infecciones en tracto urinario 2 2. Explique el fundamento de la tinción negativa y que tipo de información se obtiene. Es una técnica de microscopia que permite contrastar las muestras mediante una sustancia opaca a los fotones o a los electrones. En el primer caso, se emplea nigrosina o tinta china; para el caso de bacterias que esporulan, esta técnica permite visualizar las esporas como entes refringentes sobre un campo de fondo oscuro.3

Bibliografía 1. Patrick r. Murray...2(2009), microbiología médica. España: elseiver 2. Pelc...