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appunti del corso della prof Silvia Farè, anno 2019-2020...

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Strutture biomimetiche e bioartificiali

9. Cell sheet engineering 25/10/19

9. CELL SHEET ENGINEERING Ci sono diversi approcci in cui si può avere una rigenerazione di un tessuto senza l’utilizzo di nessun supporto, le cellule riescono a crescere e formare dei foglietti cellullare, senza avere un materiale di supporto. Si tiene conto delle cellule che in questo modo possono parlare tra loro e permettere la comunicazione e l’unione delle cellule e rigenerare il tessuto. In queste tecniche si ha la produzione di tessuti funzionali sfruttando le capacità delle cellule di sintetizzare la matrice del tessuto senza l’uso di scaffold. In questi due approcci che andremo a vedere abbiamo un substrato che però è temporaneo, quindi andiamo a impiantare solo un foglietto formato da cellule. Come si può fare? Questo approccio di cell sheet va sotto al nome di scaffold free, perché non ho una struttura portante che mi consente di creare il tessuto. Ci sono due metodi di ottenimento:  

Self-organization: ho stimoli che fanno da input per l’organizzazione delle cellule Self-assembly: cellule che senza forze esterne si aggregano tra loro e formano foglietti.

In un caso quindi ho interazione tra le cellule, nell’altro ho un substrato temporaneo dove faccio crescere le cellule e poi lo tolgo.

Self-assembly: abbiamo un pozzetto in cui mettiamo le nostre cellule. In questo caso non voglio il substrato perché se le cellule aderissero a questo starebbero lì e non riuscirei a ottenere un foglietto perché le cellule sarebbero ben adese e non riuscirei a toglierle. Per staccarle dovrei usare degli enzimi che però tolgono i legami tra le varie cellule e si perderebbe la condizione per ottenere i foglietti. La piastra di coltura quindi è non adesiva per le cellule. Queste interagiscono tra loro e formano dei legami, formando quello che è il nostro pseudo-tessuto, che nel tempo sarà formato anche da una matrice extracellulare. Quindi otterrò un aggregato cellulare con caratteristiche 1

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simili a quelle del tessuto che voglio rigenerare. Quello che manca è la vascolarizzazione, ovvero ottengo un tessuto fatto dalle cellule di interesse ma manca tutta la parte di vascolarizzazione. Una volta ottenuti questi foglietti cellulari posso fare diverse cose, ovvero posso ottenere qualcosa di diverso, ad esempio   

posso arrotolarlo posso stratificarlo posso rivestirlo perché ha basso spessore (ordine di qualche centinaia di micron)

È un processo termodinamico in cui si ottiene l’ordine spontaneamente dal disordine, senza input esterni, per il principio della minimizzazione dell’energia libera. Non dò uno stimolo specifico ma sfrutto il fatto che le cellule nel mezzo di coltura cercano di unirsi, alla ricerca di minimizzare l’energia libera. Esempi: Sono stati fatti molti studi anche su trial clinici (quindi gruppi di uomini). Sono 3 approcci diversi, tutti e 3 mirati alla rigenerazione di vasi di piccolo calibro. Questi ricercatori prendono delle cellule: 

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nel primo caso arrotolando il foglietto hanno ottenuto due strutture tubolari diverse (con 2 tipologie di cellule diverse, cellule muscolari lisce e fibroblasti). Lo svantaggio di queste strutture è che mimano solo una delle tuniche del vaso ematico, quindi si è passato al secondo step si è sempre realizzati i foglietti cellulari, ma hanno arrotolati prima le cellule muscolari e sopra i fibroblasti successivamente si è deciso di fare una co-coltura, cioè hanno seminato contemporaneamente cellule muscolari e fibroblasti, in modo tale da avere solamente un foglietto da arrotolare. Questa struttura mima esattamente un vaso ematico? Manca qualcosa, ovvero l’endotelio, realizzando un altro strato affinchè il torrente ematico si affacci con questo tessuto senza formare trombi. Le cellule endoteliali però non sono così semplici da coltivare e da collegare tra di esse, quindi hanno evitato questo step.

Questo studio sembra un’ottima soluzione, ma lo svantaggio di un approccio di questo tipo è che richiede del tempo ottenere i foglietti, quindi è un problema. Vediamo il tempo come un problema perché in caso di procedura di emergenza questo approccio non va bene. 2

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Altro studio: approccio molto diverso dal precedente, anche in questo caso è per rigenerazione di organi tubolari (vasi di piccolo calibro, ma poi questo gruppo di ricerca ha sfruttato questo approccio anche per la rigenerazione della trachea). L’approccio è realizzare degli anelli e far saldare diversi anelli tra loro, metterli in coltura e ottenere un costrutto cellulare tubolare.   

Realizzazione di stampi di diametri diversi (6-4-2) in policarbonato Ottengo un controstampo in PDSM (silicone che viene usato in ambito biomedicale) Ottenimento di un ulteriore controstampo in agarosio  qui sono state coltivate le cellule che per self-assembly si sono aggregate in due settimane

Questi anelli hanno buone caratteristiche meccaniche: prove confrontate con fibrina di collagene

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Non faccio prove né di citotossicità né di citocompatibilità perché non ho utilizzato nessun materiale, ma quello che faccio sono prove di istologie e la cosa che è interessante è vedere come si ha una certa direzionalità delle cellule, che si organizzano formando anelli che danno luogo a una certa orientazione delle cellule.

Qualche possibile problematica rispetto al fatto che gli anelli siano montati su un tubo di silicone: differente vitalità cellulare tra le cellule esterne rispetto a quelle più a contatto con il tubo in silicone, quindi posso avere un tubo che mi promuova una maggiore interazione tra le cellule e il mezzo di coltura, in modo da farlo arrivare anche in questa parte.

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Self-organization: in questo caso ho un approccio diverso, di adesione ad un substrato che ci consente di coltivare le cellule ma poi toglierle per ottenere solo il foglietto cellulare. È un processo termodinamico in cui si ottiene ordine quando l’energia o le forze esterne sono un input del sistema. Ci deve essere qualche stimolo esterno, ad esempio una forza. Se abbiamo adesione tra cellule e substrato dobbiamo usare enzimi che rompano i legami tra le cellule, quindi vogliamo qualcosa che permetta di togliere le cellule senza rompere tutto quello che le cellule hanno prodotto. Quindi avremo bisogno di un substrato che deve essere temporaneo.

I materiali che possiamo utilizzare sono quelli stimuli-responsive, che variano il loro stato di aggregazione in base alla temperatura e mi permettono di staccare i foglietti cellulari perché cambia il loro stato di aggregazione. Anche in questo caso posso fare tutte le azioni che potevo fare prima. Metto le cellule all’interno di un contenitore, nel quale ho un mezzo di coltura, per farle crescere, nel quale ho depositato un materiale. Dopo qualche giorno si forma un layer cellulare, in seguito tolgo il foglietto dal materiale, il quale ha dato lo stimolo, in questo modo ho un foglietto cellulare senza materiale. Il foglietto può essere usato per ricoprire un tessuto, per formare strutture stratificate e per formare strutture arrotolate. La forza che uso in questo caso per promuovere la proliferazione delle cellule è data dal materiale. 5

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Se abbiamo una cellula che aderisce al nostro substrato, le cellule hanno delle proteine di membrana che vanno ad ancorarsi al nostro materiale di supporto, queste cellule aderiscono al fondo del pozzetto, nel momento in cui voglio togliere queste cellule uso degli enzimi (tripsina) che vanno a rompere le proteine di membrana che hanno permesso la formazione di un legame stabile. In questo modo perdo del materiale creato delle cellule. Un altro modo è quello di usare un substrato che promuove il distacco sia della cellule, che dell’ECM, che delle proteine, quindi in questo modo ho delle cellule in uno stato più avanzato. Quindi uso un materiale che cambia dal momento in cui le cellule devono aderire al momento in cui le cellule si distaccano. Nel momento in cui ho un layer cellulare e usassi la tripsina andrei a rompere il legame cellula-cellula, si usano quindi questi materiali che tolgono l’intero strato di cellule, riesco a distaccare così dei monostrati cellulari. Passo da uno strato idrofobico a uno idrofilico del materiale che ho usato come supporto. In condizione di coltura è in condizione idrofobica, nel momento in cui devo andare a staccare il foglietto diventa idrofilico, cambia la sua affinità con i liquidi di coltura.

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I vantaggi di questo approccio rispetto a quelli tradizionali sono:    

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Non abbiamo lo scaffold, quindi impiantiamo solo cellule che possono essere autologhe quindi non abbiamo nemmeno problemi immunitari Foglietti cellulari che non hanno bisogno di suture perché si integrano con i tessuti circostanti Posso staccare questi foglietti senza utilizzo di altre sostanze Migliore controllo della semina cellulare  se prendo scaffold come nelle lezioni precedenti le cellule possono entrare nei pori ma non colonizzare nel modo atteso tutta la struttura, mentre in questo caso so che quelle cellule andranno tutte a realizzare quello che voglio ottenere senza perdite Utilizziamo materiali thermo-responsive: se riprendiamo i materiali giù visti, alcuni sono LCST e altri UCST. Per ottenere dei foglietti cellulari noi vogliamo andare verso materiali, sapendo che la temperatura è attorno ai 37°, che siano più solid-like, quindi andiamo verso i LCST (ad esempio la gelatina) Riprendendo i materiali già visti, notiamo che il NIPAAm è un materiale sintetico che a bassa T ha più interazione con l’acqua circostante, le catene sono rilassate e ad alta temperatura le catene macromolecolari si aggregano, quindi riesco a staccare il foglietto cellulare perché a bassa temperatura le catene macromolecolari hanno maggiore affinità con l’acqua e promuovono il distacco del foglietto delle cellule.

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PIPAAm: copolimeri N-isopropilacrilammide (poli NIPAAm). In soluzione acquosa di poli (NIPAAM) si ha una LCST=32°C e una transizione coil-to-globue. La LCST può essere controllata preparando copolimeri con monomeri aventi diverse idrofobicità. I copolimeri con acido acrilico mostrano una transizione sol-gel reversibile aumentando T. A TLCST le catene formano strutture compatte e si ha la deidratazione. Se è idrofilico le catene sono più rilassate, se è idrofobico le catene tendono a essere più compattate. La superficie di questo materiale è termosensibile (le catene di poli-N-isopropilacrilammide sono innestate sul fondo della piastra di coltura in PS). A 37°C ho una superficie idrofobica e l’adesione cellulare, mentre a 20°C ho una superficie idrofilica e il distacco del foglietto cellulare (nessun agente enzimatico per il distacco). Generalmente questo materiale serve per trattare superficialmente le piastre di coltura o altri materiali.

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Semino le cellula nella condizione in cui le catene sono compattate, poi abbasso la temperatura e le catene tendono a distendersi e il layer di cellule si distacca dal materiale. Riesco a distaccare il foglietto cellulare abbassando le temperatura (da 37 gradi a 20), le cellule non patiscono. Per testare la vitalità delle cellule li metto in un altro pozzetto e vedo se riescono a colonizzarlo. La transizione termina avviene nel giro di 10/20 minuti. In questo meccanismo sfrutto il cambiamento idrofobico-idrofilico del materiale.

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Esempio: con questo approccio si fanno delle piastre di coltura che vengono poi vendute. Questi materiali permetto l’adesione delle cellule e poi il loro distacco. Posso avere delle cellule che di fatto non arrivano a confluenza (non formano i legami), ma sono delle cellule distaccate, dopo di che posso portare questo mio pozzetto di cultura a 20 gradi e riesco ad avere delle cellule in numero maggiore. Il vantaggio di questo approccio è che non uso un enzima per distaccare le cellule e ho delle cellule che stanno già lavorando e ottengo un numero di cellule maggiore (i metodi non enzimatici preservano la vitalità cellulare e le proteine di superficie). Questo approccio non è utilizzato per fare foglietti, ma per aumentare il numero di cellule. Si compie il trasferimento del piatto di coltura a temperatura ambiente per raccogliere le cellule in sospensione o in forma di cell sheet. Queste cellule poi possono essere usate anche per essere coltivate sullo scaffold. Se invece voglio ottenere un foglietto cellulare su questi substrati, uso un materiale termosensibile che passa da idrofobico e idrofilico, il foglietto si stacca, ma devo toglierlo dal contenitore. La tecnica più utilizzata è quella di recuperare il foglietto cellulare con un materiale adesivo per le cellule (film di gelatina). Le cellule, mantenendole a contatto per poco tempo, aderiscono al film di gelatina e ho un supporto che i permette di togliere il foglietto cellulare dal mio contenitore. Poi posso prendere il layer e portarlo nel luogo desiderato e rimuovere poi la membrna, oppure metterlo in un altro pozzetto. Un altro approccio è l’aspirazione del foglietto, e poi il foglietto può essere direttamente impiantato e posto in un altro pozzetto, questo non va a influenzare le cellule. Altri ricercatori hanno pensato di tagliare in piccoli pezzetti il layer e aspirarli. Esempio ingegnerizzazione della superficie oculare: ricostruzione della superficie oculare attraverso la cell sheet engineering con smart hydrogels (PIPAAm). Da una biopsia della mucosa orale del paziente di isolano cellule epiteliali autologhe, le cellule vengono seminate su un superficie thermo-responsive in PIPAAm, dopo 2 settimane di coltura, il foglietto cellulare viene rimosso a T=20°C. A questo punto si ha la formazione di un foglietto cellulare dell’epitelio della mucosa orale. In seguito si ha la rimozione chirurgica del tessuto danneggiato dalla superficie corneale, infine si ha il trapianto del foglietto cellulare, senza suture. Esempio rigenerazione del legamento paradontale: le cellule del legamento paradontale sono state messe in piastra di coltura thermo-responsive ottenendo il foglietto cellulare. In seguito si ha il trapianto del foglietto 10

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di cellule di legamento paradontale. Dopo 4 settimane dal trapianto si ha la rigenerazione del legamento paradontale. Un altro materiale è la metil-cellulosa, anche se ha una Tg di 50°  si usano sali che permettono di abbassare la Tg e renderla utile per applicazioni biomedicali Si ottiene dai derivati della cellulosa, quando il bilanciamento idrofilico/idrofobico è ottimale avviene una transizione sol-gel in acqua. L’acqua diventa un solvente povero all’aumentare della T, quando prevalgono le interazioni polimero-polimero, permettendo la formazione di un gel. A bassa temperatura ha affinità con l’acqua, mentre è idrofobico ad altre T, inoltre c’è un cambiamento delle viscosità del materiale nel passaggio di questa transizione. Posso variare la T di transizione aggiungendo alla metilcellulosa dei Sali (è intorno a 50 gradi), uso dei sali per abbassarla a una temperatura tra i 30 e 35 gradi, in questo modo ho un substrato con un’elevata viscosità, quando abbasso la T diventa più sol e permetto il distacco dei foglietti cellulari. Si sono provati molti sali che fanno abbassare la Tg tra i 35-70°.

Un test semplice per verificare che la T attesa sia intorno a questo range è il test di inversione: si prende il materiale che si mette ad una determinata T e si vede quando cambia viscosità. Lo posso studiare in modo semiquantitativo ma posso vedere quanti materiali si comportano in modo inatteso. Si valuta la citotossicità di questi materiali: ci può dare informazioni 11

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circa la tossicità dei Sali utilizzati (  a diverse concentrazioni questi Sali potrebbero essere internalizzati e portare alla morte delle cellule)

Più o meno tutti i Sali utilizzati avevano un buon confronto. A quel punto si passa a citocompatibilità per capire se può avere influenza la diversa quantità di metilcellulosa sul comportamento cellulare. Si vede che dopo 48h non ci sono effetti. Facendo poi una prova al microscopio osservo che non ci sono differenze morfologiche tra le cellule. Per osservare che si integri bene si può prenderlo e metterlo sul fondo di una piastra di coltura: se le cellule del foglietto vanno a proliferare e colonizzare il pozzetto le cellule sono vitali, per cui sentono il substrato della piastra come un buon mezzo per proliferare e migrano.

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