Chimiométrie PDF

Preview

Summary

Download Chimiométrie PDF

Description

Chimiométrie

M1

Bâtiment B - 3ème étage : TP ! Examen : cours + TP ! _______________________________________________________________________________________!

CHIMIOMÉTRIE On applique à la métabolomique. OMICS ? - La génomique, c’est quand on s’intéresse à l’ensemble des gènes d’un organisme. Biologie humaine pour trouver les anomalies génétique. En terme de dimension la génomique on s’intéresse a 30 à 50 000 gènes. Génome stable, au court de la vie de l’organisme les gènes restent presque les mêmes. (sauf modification due à exposition radioactive par exemple) Gène pas forcément transcrit pour être traduit, pas une utilisation des gènes obligatoires. Pour en savoir plus, il faut savoir quel gène est transcrit => la transcriptomique On regarde les gènes transcrits, on est au niveau de l’ARN On sait ce qu’il risque de se passer au niveau de la cellule, l’organisme. Ce qui est transcrit ne va pas tjs donner des protéines (au niveau des ribosomes). Pour en savoir plus sur comment ça se passe ? On s’intéresse à toutes les protéines traduites On regarde l’ensemble => la protéomique Les protéines responsables de phénomène génomique, de biosynthèse. Parfois les protéines sont non fonctionnelles.

➣ MÉTABOLOMIQUE : métabolome On s’intéresse donc au métabolome : ensemble des métabolite que l’on trouve dans un organisme, liquide biologique, cellule, on se sert des connaissances sur les métabolites pou une étude. L’objectif avoir des hypothèse our comprendre des phénomènes. Il est nécessaire d’avoir de la chimie car la bio et aussi de la chimie. Le métabolome n’est pas stable, en fonction des conditions extérieurs on va pouvoir avoir des modifications, en particulier chez les végétaux (métabolite synthétiser suite à un stress). Metabolome : end products go gene expression and can define the biochemical phenotype of aa cell or tissue. Quantitative and qualitative measurements of large numbers of cellular metabolites provide a broad view of the biochemical status of an organism that can be used to monitor and assess gene function Metabolomics : comprehension profiling of metabolome. Le phénotype est l’ensemble des caractères observables et comparer à autre chose dans d’autres conditions. Métabonomics est pareil sauf que la seule différence, terme réserver pour les étude sur la biologie humaine (pathologie). Le but est déterminer des bio-marqueurs, début des étude pour essayer de trouver des bio-marqueurs d’une pathologie (groupe de malade comparé à un groupe sein).

Page 1 sur 8

Chimiométrie

M1

Prise d’empreinte métabolique, on prend mais on s’en fou de ce que c’est mais surtout y a t’il des pics correspondant à la maladie, classification échantillon malade ou pas malade. On parle de spectre métabolique, un spectre spécifique à une pathologie. On sait pas ce qui est derrière les pics on connait juste le spectre typique d’une pathologie. La métabolomic est du profilage ou de l’empreinte Grande diversité de métabolique : - constitutif : primaire et secondaire sont tous le temps dans l’organisme Primaire besoin nécessaire, serviront au fonction indispensable à la survie de l’espèce, nutrition et reproduction. Secondaire pas forcément nécessaire, sert à autre chose, près souvent métabolite de défense chez les végétaux. Trouver uniquement chez les végétaux, organisme particulier (algues, microorganisme, bactérie, levure) Non constitutif : - phytoalexine : métabolite synthétiser sous action d’un stress particulier, métabolisme secondaire. Ils ne sont pas constitutif, sans le stress pas ces métabolites. (hormones particulières chez les végétaux) métabolite exogène : provienne d’un autre organisme, des parasites envoient des métabolite dans l’organisme parasiter. Organisme symbiotique, de la pollution ou élément chimique capter par le végétale ou l’animal. Les produis naturels sont des substances chimiques produisent par des végétaux, principalement métabolite secondaire. Sert à élaborer les médicaments. 3500 métabolites dans une plante. Chaque année environ 4 000 nouveaux métabolites. On a identifier que 15 pourcent des constituants chez les végétaux. La diversité de ce métabolite rend les choses un peu compliqué. ➣ MISSION DE LA MÉTABOLOMIC Étude de manière globale, joué une rôle dans l’abréaction de nouvelle thématique : La biologie des systèmes Concept qui nous dit de s’intéresser à quelque chose on doit également prendre tout ce qui est autour de ce quelque chose. Le diabète, biosynthèse du glucose, la glycémie on regarde tout ce qui ce passe au niveau de l’ensemble des voies métaboliques. Concept qui doit donner la possibilité de traité chaque patient individuellement. Un traitement qui est ainsi spécifique. S’intéresser à un ensemble de chose, pour trouver des choses que l’on avait pas prévu de trouver. On regarde de manière globale, dans la biologie des systèmes on va encore plus loin, étude globale métabolique combiné avec étude protéomique, génomique et autre. (BIG DATA) Possibilité de combiné des données divers pour avoir des conclusions beaucoup plus fine. Intégration de différent type de donnée (écologique, …, clinique), le but est de mieux comprendre comment fonctionne l’organisme vivant.

Page 2 sur 8

Chimiométrie

M1

➣ GENERAL PROCEDURES OF METABOLOMICS Combinais des stats à des données chimie analytique. On commence par faire la récolte des échantillons. Procédure générale : - récolte des échantillons (flacon d’urine, feuille, …), réalisation de l’étnobotanic (on essaye de déterminer des nouveaux principes actifs dans les végétaux à partir de pratique thérapeute, pour soigner certaine maladie) - On extrait les échantillons, prise de précaution pour les conservés intactes pour que lors des analyses les métabolites soit pas dégradé. Moins il y a d’étapes et moins il y a de risque d’abimer les métabolites. Extraction et détachement de la matrice animal ou végétale. Analyse statistique = certain nombre de répétition et une certain répétabilité dans la façon de faire. Le protocole opératoire et standardiser pour avoir des résultats pour par rapport à ce que l’on recherche. Diapo qui reprend le protocole précis pour un échantillon d’urine : - collecter l’échantillon sous conditions de réfrigération particulière - ajouter 1% poids volume de la sodium azide pour diminuer la croissance bactérienne - on récupère les échantillons dans des raques participer - analyse RMN avec sonde particulière - centrifugation bac 96 puits - mélange de l’urine avec un tampon phosphate : important pour ne pas avoir de modification du pH

.

Métabolite sous forme différente si pH pas identique (basique/acide) pas la même observation, qui vont apparaitre comme des constituants différents

SAMPLE PREPARATION OF PLASMA : Idem standardisation spécifique WHAT IS THE IDEAL EXTRACTION METHOD ? Quantitatif et rapide, car beaucoup d’échantillon à passer. Sélective ou non en fonction de l’analyse, concentrer les analyses sans le dégrader mais aussi respectueuse le l’humain et de l’environnement. Mai également qu’elle soit économique. Un certain nombre de famille chimique différente et un certain nombre de solvant organique d’extraction potentiel. On pourra jamais extraire tous les métabolites avec un seul solvant (polarité différentes). Un solvant qui va avoir une gamme d’extraction très large sera u solvant hydro alcoolique. Il permet d’extraire des métabolites polaires mais également moins polaire. analytique plus ou moins sensible. Méthodes d’analyses qui permettent de détecter des métabolites - robustesse du signal : traitment puis numérisation - temps de mesure cours, étude globale avec analyse statistique (bcp échantillon donné) on doit faire de l’analyse à haut débit et donc on a besoin que la méthode analytique ne prenne pas trop de temps.

Page 3 sur 8

Chimiométrie

M1

MÉTHODE ANALYTIQUE Les plus utilisés sont : - RMN - Spectro de masse Méthode chromatographie : liquide et phase gazeuse avec détecteurs derrière (UV, IR, DEDL presque universel). Chromato sur couche mince (CCM), mais aussi avec de l’électrophorèse capillaire. La spectrométrie de masse, par infusion direct. On obtient directement le spectre de masse sur notre produit solide (injection direct). Ce qui va être le plus utiliser c’est la RMN et la GCMS

figure 1 : Électrophorèse capillaire

spectrométrie de masse. En fonction des méthodes chromato, résolution plus ou moins bonne. GCMS en métabonomic, la résolution chromatographie phase gaz est meilleur. On analyse plus de composé en un même temps. La ionisation utilisé on des impact électronique, pas mal d’ionisation chimique mais aussi de l’électro-sprais. Des bases de donnés en GC que en LC. En LCMS les base sont moins reproductible d’un appareil à l’autre. Les bases de données permettent d’identifier un maximum d’analyte. La CGMS limiter niveau moléculaire, le métabolite doit être volatil pour être analysé. LES DIFFÉRENTS TYPES D’ANALYSEUR : En LC-MS 2 très utiliser - le Maldi-TOF - le ESI-Quadrupole MÉTHODE DE NON CHROMATOGRAPHIE : RMN L’avantage de la RMN observation simultané de toute les classes de produits chimiques observés en RMN. Très pratique, on commence à utiliser la RMN du moment ou on regardait tout sans savoir ce que l’on veux regarder. En RMN analyse sans préjuger ou appryorie. Quantification assez simple à partir d’un spectre RMN par intégration du pic de proton, sans avoir de composé de référence. Utile pour des élucidations structurales. Méthode non destructive, récupération de l’échantillon pour combinais ensuite les données. Machine compatible avec l’utilisation à haut débit «" Hight Throughput" ». Haut débit pleins d’analyse rapidement à la suite. Autre intérêt, résultat indépendant de l’instrument sur lequel on travail. Même spectre obtenu avec plusieurs appareil. Pas besoin de logiciel spécifique pour faire un traitement de donné. Mais un gros désavantage, la RMN beaucoup moins sensible que la spectrométrie de masse.

La RMN ou NMR en anglais, technique récente, technique qui connait des développements informatique et des aimants. Méthode découverte par Bloch et Purcell juste avant la deuxième guerre mondiale. (Prix nobel en 1952) Spectre RMN ou image due au micro ordinateur (puce) permettant de traité beaucoup plus de donner au lieu d’un spectre ⇾ l’IRM.

Page 4 sur 8

Chimiométrie

M1

Développement au niveau des aimants, du traitement de signal et du type de séquence que l’on met en place en RMN. Séquence en RMN, petit programme permettant de faire des spectres protons. Deux façon d’expliquer la RMN : - ce qui se passe mécanique cantique et différence d’état énergétique - la théorie des vecteurs RMN on travail facilement sur des mélanges. Propriété magnétique de la matière, nombre de protons, nucléons et neutrons. POur pouvoir faire de la RMN il faut que le noyau est un spin non nul. SPIN nombre non nul, spécifique au noyau (nul ou positif). ⇾ PHOTO SPIN non nul confère un mouvement synéthique au noyau permettant d’avoir un mouvement magnétique grâce à un autre paramètre le rapport gyromagnétique caractéristique du noyau (gamma). A impair

I est un demi entier

I =1/2 : 1H, 19F, 13C! I=3/2 : 11B, 23Na! I=5/2 : 17O, 27Al

A pair et Z impair

I est un entier

I = 1 : 2H et 14N ! I = 3 : 10B

A pair et Z pair

I est nul

I = 0: 12C, 16O

obtient un mouvement de précession (LARMOR). La vitesse angulaire fonction du champ magnétique et rapport gyromagnétique. Nu 0 est la fréquence de résonance, différente si proton ou carbone. Un spectre RMN est fait sur un ensemble de particule, on va avoir plusieurs fois un mouvement dans le sens de B0 ou anti parallèle a B0. Correspond à deux état énergétique 1/2 et -1/2. Si on fait la somme des mouvements elle sera dans le sens de B0. On créé une excitation, modification de l’état d’équilibre par l’ajout d’un champ magnétique supplémentaire B1 mit le long de Ox. On ajoute une bobine métallique dans lequel on fait passer un peu de courant, au milieu de la bobine on aura un champ magnétique B1. On va avoir une émanation macroscopique qui va faire basculer B0 dans le plan et être attiré par B1. On arrête l’excitation et a nouveau B0 retourne à l’équilibre, mouvement de précession de l’Larmor entraine une remise en équilibre avec un mouvement sur lui même (mouvement complexe). Un champ magnétique qui va bouger selon un mouvement circulaire, créant un champ électrique (courant électrique). Le courant électrique fem 1/2 (force électromotrice). On a un signal électrique qui permet de savoir que l’on a un noyau dans le tube RMN. On récupère le signal via la bobine et on obtient un signal atténuer au court du temps (FID : free induction decay = signal de précession libre). Obtention d’un signal avec une fonction sinus amortie, une intensité en fonction du temps. On obtient un final par rapport à notre noyau. Mais l’analyse

Cela donne les pics en RMN.

Page 5 sur 8

Chimiométrie

M1

La FID qui correspond à un noyau (rouge, bleu, …) donne un pic => détermination des pics selon le déplacement chimique. L’environnement électronique influence sur le déplacement chimique caractéristique. Lorsque l’on a un mélange on sort des pics caractéristiques des produits du mélange, analyse de mélange complexe. Pas besoin de séparer les analyses avant d’analyser. APPAREILLAGE Un crio-aimant : grand champ magnétique qui fait B0, aimant qui est maintenu très froids dans de l’hélium liquide (-300°C). Cela s’explique par, la bobine métallique est faite d’un matériaux supra conducteur. Un coups d’électricité donnant B0, maintien l’électricité le temps que c’est froids. explication : Matériaux supra conducteur caractérise très particulière, à température basse il perd sa résistance électrique (U=RI), il y a plus de R donc plus de perte d’effet joule. Le supra conducteur ne perd plus d’énergie par effet joule. Une fois l’électricité mise il ne l’a perd plus. Champ magnétique nettement plus élevé. Une bobine entourant l’échantillon produit le champ d’excitation B1 et enregistre les signaux de précession libre. Deux grands types de sonde : - normal - inverse Correspond à la géométrie de la sonde. Pour faire des séquences envers HNQC séquence bio-dimensionelle, il faut une sonde inverse. Différents spectre RMN dans différentes conditions pour comparer, alignement des spectres. On met dans des petites saut, on découpe le spectre RMN en plusieurs petits bout (Découpage tous les 0,04 ppm). Spectre proton 10ppm environ. Intégration des pics on prend la valeur d’air et pour chaque requête, cela nous donne les valeurs numériques. On transforme ce spectre en valeur (each bin) en fonction des simples. On transforme nos données analytique en donnés numériques. Variable numérique on un intérêt numérique pour faire des stats sous fichier Excel. Méthode de comparaison : ANALYSE MULTI VARIER Une droite de régression linéaire d’un nuage de point. On détermine un model qui va le mieux rendre compte du phénomène (nuage de point). Sytème à deux dimensions, x et y. Les dimensions seront les valeurs variables au nombre de 250 facteurs, soit 250 coordonnées, analyse par composante principale, type d’analyse multi varier le plus classique. Permet de faire de la réduction de donnée en utilisant une méthode de type régression des moindres carrées. Permettant de réduire nos variables observés à un tout petit nombre de variable (on passe de 250 à 2 ou 3) on tire les principales. Technique de groupage, qui est non supervisé. Cela signifie que lorsque l’on demande à la machine de faire l’analyse on ne lui dit pas qui est quoi (référence, échantillon x, z …), la machine fait son model et donne les différents groupes. PHOTO : Principal component analysis (2) On a deux grand type d’analyse multiparité ACP et PLSDA - Grosse différence PLSDA, on force les choses (le model), une analyse supervisé : intérêt dans le rassemblement des groupes et de savoir les métabolites qui vont différencier un groupe d’un autre pour savoir notre bio marqueur. - ACP on sait pas qui est quoi

Page 6 sur 8

Chimiométrie

M1

Les 2 ou 3 signaux ont prendre en compte les caractéristiques de 500 signaux de bases. PHOTO : summary of principal component analysis Une valeur qui correspond à une aire observé pour chaque échantillon. PHOTO : Example of principal component analysis (3) Un diagramme de charge, différente valeurs des variables en ppm. On va avoir les valeurs en ppm pour ensuite allé rechercher le métabolite.

Page 7 sur 8

Chimiométrie

M1

Développement d’une approche métabolique par RMN pour la caractérisation de biomarqueurs chez l’homme : Application à la calcification vasculaire Trouver une bio marqueur. Détection par un scanner, quand on a déjà la maladie. Méthode prédictive, et peu couteuse. La métabolomique, échantillon de sérum de patient malade et sein. Plusieurs catégorie de patient, calcification faible, moyenne et importante. Traitement des échantillons, hyphylisation, utilisation d’un solvant. Utilisation de la RMN pour ce type d’analyse, une séquence particulière trouvé par RMN du proton avec un filtre qui permet d’évitent d’avoir une distorsion de la ligne de base. Séquence d’impulsion de Carr Purcell Meiboom Gill (CPMG). Numérisation des données pour l’exploitation : - échantillons malades - // témoins => diagramme de Scoor Blot ACP (l’algorithme ne prend pas en compte le groupe) : Pic de molécule discriminante que l’on retrouve tout le temps dans un type d’échantillon. On numérote les échantillons et on leur donne un valeur. On a trouver 13 valeurs requête qui avait une valeur statistiquement différente entre le rouge et le bleue. Réalisation de l’étude des zones, zone avec discriminant chimique de … ppm … . Détermination de molécules par des bases de données du laboratoire et en ligne (HMDB) humain metabolome data base. La molécule peut être identifier, c’est la CRÉATININE. Ce n’est pas un bio marqueur de ce que l’on chercher mais plutôt d’une insuffisance rénale chronique. Schéma de l’ACP de la population malade seule : discrimination forme entre groupe 1 et 3 les 2 extreme. Le groupe 2 est entre les 2. L’intérêt est de montrer que l’on a une méthode pour discriminer et la possibilité d’une application par détermination des bio marqueurs. SPIKING : est une méthode lorsque que l’on a l’impression d’avoir cette molécule, on le rajoute dedans pour voir si le pic à bien augmenter.

Page 8 sur 8...