Cinetique Enzymatique Michaelienne PDF

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Cinétique Enzymatique Michaélienne 1. La réaction enzymatique E S P La vitesse de la réaction nous donne: v = d[P] / dt = d[S] / dt

Vi = vitesse initale

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Influence de la concentration en Enzyme

Vi varie en fonction de la [E] et [S] d'où: vi = f([E] . [S])

[E]

Vi

[E1]

V1

[E2]

V2

[E3]

V3 => vi = f([E])

Lorsque l'on a [S] élevé, on a une vitesse initiale proportionnelle à la concentration en Enzyme => [S] élevée = vi = k . [E]

Remarque sur la courbe: 1: [E] = 0 --> vi ~ 0 --> la vitesse est négligeable 2: la zone linéaire stagne au bout d'un certain temps ( - - - - ). Si on augmente le concentration en substrat, alors la zone linéaire reprend. Parfois, à partir d'une certaine concentration, la concentration en enzyme diminue, ce qui ne donne plus de zone linéaire. Si on a: vi = k . [E] => [E] = 1/k . vi On exprime [E] en « concentration catalytique ».

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Influence de la concentration en Substrat

1 S P 2 On mesure Vi, ici [P] est négligeable, on peut presque écrire S --> P.

[S]

Vi

[S]1

V1

[S]2

V2 => vi = f([S])

Ici on ne peut pas écrire vi = k . [S] Vm = vi ([S] = ∞)

vi = k . [S] n L'ordre de la réaction varie en fonction de la concentration en Substrat

Ordre 0 Ordre 1 La cinétique chimique ne s'applique pas toujours à l'enzymologie.

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Hypothèse de Michaelis k1 k3 S + E ES E + P k2 complexe Enzyme - Substrat

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Hypothèse de Michaelis implique la Phase stationnaire

ici vi « stationnaire » --> [ES] = constante => vi = constante vi = d[P] / dt = d[S] / dt vi = k3 . [ES] La relation de Michaelis s'applique que pendant la phase stationnaire. 0 --> t1: phase préstationnaire, environ quelques secondes => inaccessible par des mesures classiques t2 --> +∞: phase post-stationnaire vi = d[P] / dt =constante = phase stationnaire Si la phase stationnaire n'est pas visible, vi = tangente à la courbe

2. L'équation de Michaelis Elle ne s'applique qu'en phase stationnaire vi = constante il faut que [P] soit négligeable donc E + P -XX > ES k1 k3 E + S E-S E + P k2

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La constante de Michaelis

v1 = k1 . [E] . [S] v2 = k2 . [ES] v3 = k3 . [ES] or -d[S] / dt = -k2 . [ES] + k1 . [E] . [S] vitesse de disparition du substrat: vi = d[S] / dt = k1 . [E] . [S] – k2 . [ES] Or – d[S] / dt = d[P] / dt vitesse d'apparition du produit: d[P] / dt = k3 . [ES] D'où: k1 . [E] . [S] – k2 . [ES] = k3 . [ES] k1 . [E] . [S] = k3 . [ES] + k2 . [ES] = (k3 + k2) . [ES] => (k3 + k2)/ k1 = ([E] . [S]) / [ES] or k1, k2, k3 sont des constantes de vitesse d'où: (k3 + k2)/ k1 = KM KM = ([E] . [S]) / [ES] Analogie avec l'équilibre chimique: k1 k3 E + S E-S E + P k2 KA = [ES] / ([E] . [S]) et KD = ([E] . [S]) / [ES] Donc KM est considéré comme une constante de dissociation « apparente » du complexe E-S. K3 = s-1 nombre de molécules de Substrat transformées par un molécule d'Enzyme par seconde Produit formés

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Équation de Michaelis

[Et] = [E] + [ES] KM = ([E] . [S]) / [ES] --> [E] = (KM . [ES]) / [S] remplaçons: [Et] = ( (KM . [ES]) / [S] ) + [ES] multiplions par [S] => [Et] . [S] = (KM . [ES]) + [ES] . [S] => [Et] . [S] = [ES] . (KM + [S]) => [ES] = ( [Et] . [S] ) / (KM + [S]) multiplions par k3

=> k3 . [ES] = k3 . ( ( [Et] . [S] ) / (KM + [S]) ) or vi = k3 .[ES] => k3 . [Et] = vi max ce qui nous donne: vi = (vi max . [S]) / ( KM + [S])

Relation de Michaelis

vérification de la courbe expérimentale: S très grand (par rapport ) KM) S>>KM vi = (vi max . [S]) / (KM + [S]) alors vi = vi max S très petit S KM + [S] = 2[S] donc KM = [S] KM est la concentration en substrat quand vi = v max /2

KM => [S] quand v i = v max / 2 KM => constante d'association partielle KM => (k2 + k3) / k1 = ([E] . [S]) / [ES]

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Détermination de KM et Vm

Lineweaver et Burk (double inverse) vi = (v max . [S]) / (KM + [S]) 1/ v i = (KM + [S]) / (V max . [S]) 1/vi = ( (KM / v max) . (1/[S]) ) + ( ([S] / [S] ) . (1/v max) ) 1/vi = (KM / v max) . (1/[S]) + (1/V max) 1/vi = f (1/[S]) 1/[S] = 0 remplaçons: 1/vi = 1/v max d'autre part: 1/vi = 0 0 = (KM / v max) . (1/ [S]) + (1/V max) 0 = KM / [S] + 1 => KM / [S] = -1 d'où: 1/[S] = -1/KM

Cette méthode a un défaut: très souvent il faut négliger un point, celui qui a la plus petite [S]. Donc la droite retenue est nécessairement celle où on néglige ce point extrême.

Eadie Vi = (V max . [S]) / (KM + [S]) (vi . (KM + [S]) ) / [S] = V max vi = (KM / [S]) + Vi = Vmax

=> Vi = (-Vi / [S]) . KM + Vmax y = -x . a + b

Eisenthal et Cornish-Bowden

Méthode qui possède le moins de « biais »

3. Calculs et significations des “constantes” en enzymologie •

KM k1 k3 E + S E-S E + P k2

KM = ([E] . [S]) / [ES] = (k2 + k3) / k1 En général k3...