Criofractura PDF

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criofractura Es el proceso mediante el cual muestras biológicas, se congelan, fracturan y replican para generar un “molde” de carbono/platino destinado al examen por microscopia electrónica de transmisión. Esta técnica ha sido importante para exponer las relaciones de estructura y función en células y tejidos, es un método que a demostrados ser esclarecedor al revelar las características ultraestructurales y especializaciones de las membranas biológicas. Metodología empleada: La premisa básica de la fractura por congelación es que las membranas se dividen a través de la bicapa lipídica mediante este proceso. El proceso se inicia congelando células y tejidos con la velocidad suficiente para limitar la cristalización del hielo, esto acompañado con el uso de agentes crioprotectores como el glicerol. Luego, las muestras se fracturan a temperaturas enfriadas con nitrógeno líquido a alto vacío. La superficie fracturada resultante se replica y se estabiliza por evaporación de carbono y platino desde un ángulo que confiere detalles tridimensionales de la superficie al molde. La muestra original se visualiza a partir de la réplica en una cuadrícula de muestra EM estándar del microscopio electrónico. Equipo: La instrumentación para fractura y replicación consiste en una cámara de alto vacío con mesa de muestras y brazo de microtones con rendimientos de nitrógeno líquido regulables. La cámara también alberga dos pistolas de electrones, una para estabilizar la evaporación de carbono colocada en un ángulo de 90º con respecto a la etapa de la muestra y la otra para el sombreado de platino / carbono en un ángulo ajustable, típicamente 15º - 45º. La energía a la unidad se aplica para operar la bomba de vacío y los paneles electrónicos regulan el ajuste de temperatura y el control de la pistola electrónica.

Carson, J. L. Fundamental Technical Elements of Freezefracture/Freeze-etch in Biological Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (91), e51694, doi:10.3791/51694 (2014)....