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UNIVERSIDAD DE NARIÑO Facultad de Ciencias Agrícolas Ingeniería Agronómica-V Semestre Genética Cristian Mauricio Cuastumal Guaitarilla Carol Nathalia Maya Cuasquen Daniela Fernanda Mayac Chagueza

GRADO DE VARIACIÓN GENOTÍPICO Y FENOTÍPICO DE Drosophila melanogaster CRUCE ENTRE HEMBRAS WHITE-EBONY Y MACHOS SILVESTRES

RESUMEN: La Drosophila melanogaster es una especie de moscas, conocida como la mosca de la fruta, es llamada así, ya que se encuentra alimentándose de frutas en el proceso de fermentación esta especie en particular es muy usada para los experimentos de genética, ya que ella posee un reducido número de cromosomas (4 pares) y su tiempo de vida es muy corto. Su reproducción es muy rápida por lo que asi se puede conocer mejor la descendencia.. En el presente informe se evalúa las proporciones en la descendencia F2 del cruce entre las cepas de machos Silvestre (W +W+) y White Ebony (we) de Drosophila melanogaster; la metodología consistió en un aislamiento sexual de cada cepa para tener un control del número de parentales, seguidamente se realizó el cruce directo y reciproco de las mutaciones, obteniendo la F1 a los 8 días de realizado el cruce. Finalmente se realizó el cruce entre los individuos de la F1, anticipado de un aislamiento sexual para evitar contaminación y así obtener la F2. Se encontró mediante la aplicación de una prueba de contingencia que no existía una diferencia significativa entre las frecuencias observadas y las esperadas, concluyendo que el cruce directo se ajusta a las proporciones fenotípicas 9:3:3:1 y 6:6:2:2 para el cruce recíproco, siendo el fenotipo silvestre el carácter dominante. De esta manera se identificó los fundamentos de la herencia y la variación que son considerados por la genética. Palabras Clave: Genética- D. melanogaster- Silvestre- White Ebony- Herencia- Prueba de Contingencia.

1. INTRODUCCIÓN: La mosca de la fruta, conocida como Drosophila Melanogaster en el ámbito científico, es un pequeño insecto que pertenece al orden de los dípteros. Se utiliza de forma generalizada en la investigación científica y médica. Este insecto de 3 mm de largo normalmente se acumula alrededor de la fruta estropeada. Se ha utilizado en la genética y la biología de desarrollo durante casi un siglo y en la actualidad varios miles de científicos trabajan en muchos aspectos diferentes de su biología. Ha sido empleada como material experimental por W.E. Castle, en 1906. La importancia de

Drosophila como modelo animal fue descubierta por Thomas Hunt Morgan, que consiguió el Premio Nobel de Fisiologia y Medicina en 1933 luego de haber demostrado que los cromosomas portan la información genética, utilizando la Drosophila (Leivine & Schwartz, 1973). Desde entonces, este pequeño insecto, que se cria rápidamente y se mantiene con facilidad en un laboratorio, ha desempeñado un papel fundamental en la investigación genética. Su importancia para la salud humana ha sido reconocida mas recientemente con el Premio Nobel de Medicina en 1995, por su trabajo sobre el control genético del desarrollo embrionico temprano. Hay moscas mutantes con defectos en cualquiera de los varios miles de genes

disponibles y recientemente se ha secuenciado todo el genoma. La Drosophila tiene cuatro pares de cromosomas: un par que determina el sexo; los otros tres pares son autosomas. Son ideales para determinar si ciertos estímulos causan ciertas mutaciones. Las mutaciones comunes observadas en las moscas de la fruta incluyen la estructura de las alas y la variación del color de sus ojos. Las mutaciones de las alas pueden causar que estas sean cortas o retorcidas. Estas moscas son conocidas por sus ojos rojos; no obstante, las mutaciones pueden causar que ciertos especímenes tengan ojos blancos o dorados, e incluso pueden producir moscas sin ojos. Las mutaciones también pueden cambiar la coloración de su cuerpo haciéndolo de color amarillo o negro, cuando el cuerpo de la mosca de la fruta común es habano claro. (Strinchberger, 1962)

Igualmente, ha sido utilizado para más estudios trascendentales de desarrollo, ligamiento, epítasis y genética cromosómica (Fernández et al.2002& Pierce 2010). Debido a la gran cantidad de estudios genéticos que se realizan con esta mosca, es importante conocer que características hacen que Drosophila melanogaster se tenga como un modelo biológico (Fernández et al.2002).         

Eucariota pluricelular. Cuatro pares de cromosomas totalmente mapeados. Genoma totalmente secuenciado. Ciclo de vida corto. Organismo holometábolo. Discos imaginales. Descendencia numerosa por generación. Cientos de mutantes con defectos en miles de genes disponibles. Fácil cultivo y manutención barata.

Dichas particularidades han sido de gran utilidad para obtener un alto grado de reproducción. Mutación.

2. OBJETIVOS 

General

Poner en práctica los conocimientos obtenidos en clase acerca de la herencia de genes y las leyes de Mendel. 

Específico

Identificar genotípicamente y fenotípicamente, los resultados de los cruces que se llevaron a cabo en laboratorio. Tanto de la F1 como para la F2. 3. MATERIALES Y MÉTODOS Drosophila melanogaster también conocida como la mosca de la fruta o la mosca del vinagre, es considerada un modelo biológico en campos investigativos relacionados con genética, biología del desarrollo, ecología, evolución, estadística etc. En base a experimentos realizados con este organismo se construyó el primer mapa genético en 1913.

El término mutación, hace referencia a toda alteración o cambio ocurrido en la secuencia de bases del ADN de un organismo, por lo que es un fenómeno molecular y en un principio no es observable (Solari 2007). Igualmente, se puede definir las mutaciones como alteraciones genotípicas que se replican, se transmiten de generación en generación, se segregan y distribuyen. Cabe destacar que las mutaciones son la base de la evolución (Jenkins 1986). Al utilizar estirpes de Drosophila melanogaster, es posible detectar en estas varios tipos de mutaciones, entre ellas, mutaciones simples que producen efectos visibles, donde se puede incluir también algunas mutaciones ligadas al sexo. Entre las mutaciones autosómicas (NO ligadas al sexo) más comunes en la mosca de la fruta se puede mencionar: 

Mutantes de ojos: Brown (ojos café claro que se oscurecen).

 

Mutantes de color del cuerpo: Ebony (cuerpo color ébano). Mutantes de alas: Vestigial (alas y balancines muy reducidos)

Y mutaciones no autosómicas, ligadas al sexo, las cuales son características de los cromosomas sexuales. En los seres humanos existen 22 pares de cromosomas autosómicos y un par sexual. En las mujeres, este último se encuentra conformado por dos cromosomas iguales denominados XX, mientras que en los hombres, los cromosomas son diferentes y se simbolizan como XY. En la ovogénesis, se produce para las mujeres siempre un óvulo con cromosoma X, en cambio, en la espermatogénesis, la mitad de los espermatozoides va a tener un cromosoma X y la otra mitad uno Y. Para Drosophila melanogaster sucede de forma similar que en los seres humanos. Si se tiene en cuenta que los cromosomas sexuales son diferentes para machos y hembras, los genes asociados a estos cromosomas y por ende las mutaciones asociadas a estos genes, dependerán del sexo de su portador. Entre las mutaciones ligadas al sexo más comunes en la mosca de la fruta se puede mencionar:   

Mutantes de ojos: White (Ojos blancos). Mutantes de color del cuerpo: Yellow (cuerpo amarillo). Mutante de cerdas: Forked (Cerdas acortadas, retorcidas y dobladas).

Figura 1. Ciclo biológico, Drosophila melanogaster: Morfología D. melanogaster, es un insecto que pertenece al orden Díptera (Figura 1) que agrupa a aquellos organismos en donde el primer par de alas es funcional y el segundo se ha transformado en órganos del equilibrio, los llamados halterios o balancines. Es un organismo representativo de la familia Droshophiloidae la que incluye a las mosquitas pequeñas, con algunas cerdas y venación de las alas. El género Drosophila comprende varias especies de moscas con la vena subcostal degenerada, incompleta o ausente, las pertenecientes a la especie melanogaster tienen dos interrupciones en la vena costal (1830, Meigen).

Ciclo de vida Drosophila melanogaster es un insecto holometábolo cuyo ciclo de vida consta de 4 estadios; huevo, larva, pupa e imago. (Fernández et al.2002).

Figura 2. Espécimen silvestre de Drosophila melanogaster. Esta especie es utilizada para los trabajos experimentales ya que es considerado un material adecuado debido a su fácil manejo, su corto ciclo de vida y la gran cantidad de mutaciones que esta puede presentar. (Roberts, 1984)

En estudios genéticos resulta indispensable conocer de una manera general la morfología externa del adulto, para poder distinguir las características que presentan las moscas de ambos sexos o las que han sido afectadas por mutaciones. Por ende, en primera instancia Se realizó la identificación de las diferentes mutaciones existentes, estableciendo las diferencias fenotípicas. D. melanogaster silvestre (w+w+) presenta ojos rojos, de forma oval y con muchas facetas, alas de borde liso, venación uniforme que se extienden hasta más allá del abdomen y setas largas y suaves, el color del cuerpo es básicamente crema, con un patrón de áreas claras y oscuras (Figura 2).

Figura 4. Fenotipo White-Ebony de Drosophila melanogaster. Para la diferenciación entre machos y hembras se tuvo en cuenta las siguientes características para su identificación (Tabla 1):

Figura 3. Fenotipo silvestre de Drosophila melanogaster D. melanogaster White-Ebony (we), tiene ojos blancos que es una característica ligada al sexo ubicada en el cromosoma x y cuerpo de color negro, carácter autosómico recesivo situado en el cromosoma III. (Ashburner, 1989) (Figura 3).

Tabla 1. Características de machos y hembras de la especie Drosophila melanogaster. Tamaño del adulto Forma del abdomen Marcas del abdomen Peine sexual Genitalia externa del abdomen

MACHO Pequeño

HEMBRA Grande

Redondeado y corto Segmentos fusionados

Curvo, puntiagudo Bandas claras y oscuras

Presente

Ausente

Ganchos circulares

Ovopositor de la punta del abdomen

cinco frascos se pusieron 5 individuos ♂white ebony y 5 individuos ♀ white ebony. El objetivo fue obtener moscas vírgenes y separar machos de hembras las cuales serían empleadas como los parentales.

Figura 5. Hembra y macho de Drosophila melanogaster respectivamente, con sus características distintivas. Obtención y preservación de las cepas Inicialmente se preparó una especie de tapón con algodón y gaza para cubrir el medio y darle traspiración.Las cepas puras fueron conseguidas del cepario del laboratorio de entomología de la Universidad de Nariño, para su cultivo se mantuvo en frascos de vidrio con un medio compuesto por 25gr de fécula de maíz, 125ml de miel o panela, 1000ml de agua, 15 gr levadura y 6 gr de agar para espesar el medio. Después que el medio se solidificó en los frascos se taparon con el algodón esterilizado y se rotularon con la fecha, el grupo de trabajo, tipo de cepa y generación. Para la observación, clasificación y recuento de las moscas fue preciso anestesiarlas previamente con éter utilizando un frasco eterizador y una tapa reeterizadora cuando fuera necesario para evitar que las moscas despertaran. Primero se obtuvieron moscas vírgenes, a partir de cepas puras tanto de silvestre como de White Ebony en cinco frascos con medio de cultivo. En estos se colocaron 5 individuos ♂ silvestre y 5 individuos ♀silvestre, y en otros

A partir de esta descendencia obtenida y un buen aislamiento sexual verificado mediante estereoscopio, se realizó el cruce entre cepas; para esto se colocaron 4 individuos ♂white ebony y 6 individuos ♀ silvestre para el cruce directo y 4 individuos ♂ silvestre y 6 individuos ♀ White ebony para el cruce reciproco, en cinco frascos distintos que fueron marcados con la cruza respectiva y la fecha en la que se llevó a cabo el proceso. Después de cinco días se retiraron y desecharon los progenitores de ambas cruzas. A los doce días siguientes de iniciadas las cruzas progenitoras se sacaron por separado las moscas de la F1 separando machos y hembras. Cada cruza se sembró por separado en los frascos con medio de cultivo fresco. Se sembraron 6 parejas de la F1 (macho/hembra) de cada cruce por frasco, repitiendo el procedimiento anterior, de esta forma se obtuvo la F2; de estas moscas se registraron los fenotipos obtenidos así como la frecuencia con que se presentó en cada uno de los frascos, hasta alcanzar un número superior a 500 moscas. Una vez terminado el análisis estas fueron desechadas. A los resultados obtenidos se les aplicó la prueba de Chi cuadrado ( X2) para determinar si los resultados se ajustaban a las proporciones fenotípicas esperadas, el valor calculado se comparó con una tabla de X2 con un alfa de 0,5 de confianza y con un número de grados de libertad dado por el número de fenotipos menos 1.

Cronograma de actividades Tabla 2. Programación Programación – Mosca Drosophila melanogaster

Fecha 3 – Octubre - 2016 4 – Octubre - 2016 10 – Octubre - 2016 14 a 17 – Octubre - 2016 19 – Octubre - 2016 21 a 22 – Octubre - 2016 24 – Octubre - 2016 28 – Octubre - 2016 31 – Octubre - 2016 8 – Noviembre - 2016 15 – Noviembre - 2016 17 – Noviembre - 2016 17 – Noviembre - 2016 24 – Noviembre - 2016 27 – Noviembre - 2016

Actividad Se preparó el primer medio. Se realizó la siembra de 5 frascos (Moscas silvestres) y 5 frascos (WhiteEbony) Se mató los parentales. Se ubicó pupas en copas. Se preparó el segundo medio. Se sexo moscas vírgenes Se instaló las moscas vírgenes a 5 frascos para moscas silvestres y 5 frascos para moscas White - Ebony Se preparó el tercer medio. Se realizó el primer cruce y retro cruce entre Moscas parentales x Moscas parentales. Se mató los parentales del primer cruce. Generación filial 1. (F1) Se preparó el cuarto medio. Se realizó el segundo cruce y retro cruce. Moscas F1 x Moscas F1. Y se contabilizó el resultado de la progenie con sus respectivas características. Se mató los parentales del segundo cruce. Generación filial 2. (F2) Se contabilizó el resultado de la progenie con sus respectivas características.

4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Se plantearon los cruces teóricos que permitieron establecer fenotipos y genotipos esperados tanto para el cruce directo como para el recíproco, así como sus proporciones. Dichos cruces predijeron los siguientes genotipos y fenotipos para la generación F1 y para la generación F2:

A. CRUCE DIRECTO Parentales:

 

Fenotipo: Genes: Fenotipo: Genes:

CRUZA:



Proporciones: Genotipo: Proporción genotípica: Fenotipo: Proporción fenotípica:

F1 x F1 ♀

♂

Gametos:

B. CRUCE RECÍPROCO  Generación filial 1: Parentales: Fenotipo: Macho Silvestre (ojos rojos) Genes: W+ EE Fenotipo: Hembras White Ebony (ojos blancos) Genes: WW ee

CRUZA: ♀ W W ee

♂ x

W+ EE

Hembra White ebony Macho silvestre Gametos: W+

e

E

W+ W Ee

F1: 

W

W Ee

Proporciones: Genotipo: ½ W+ W Ee, ½ W Ee Proporción genotípica: 1:1 Fenotipo: Todas las hembras ojos rojos y cuerpo amarillo (½ = 50%). Todos los machos ojos blancos y cuerpo amarillo (½ = 50%). Proporción fenotípica: 1:1

En laboratorio se observaron las características físicas de 500 moscas, los resultados son los siguientes: Sexo

Característica

♀

Ojos Rojos, cuerpo amarillo

♂

Ojos White, cuerpo silvestre

Registro Fotográfico

N° de individuos

298

202

TOTAL

500

Este experimento introduce el concepto de herencia ligada al sexo que según Stansfield (1988) es: cualquier gen localizado en el cromosoma “X” o en el cromosoma Z análogo se dice está ligado al sexo. La importancia de los sexos en si es que constituyen un mecanismo que fija la numerosa variabilidad genética que caracteriza a la mayor parte de las poblaciones naturales. La explicación de los resultados obtenidos, se encuentra en el hecho de que, en los machos, el gen para el carácter ojos blancos está situado en el cromosoma “X”, mientras que falta en el cromosoma “Y” (hemicigoto). En la generación F1 el alelo recesivo “w” se transmitirá solamente a las hembras; estas, sin embargo, presentaran un fenotipo normal porque el otro cromosoma X es portador del gen

normal, que es dominante. En la segunda generación F2 la mitad de los machos recibirá el alelo recesivo y, al no poseer un segundo cromosoma X con el correspondiente alelo dominante, presentara un fenotipo con ojos blanco; mientras que la otra mitad, al haber recibido de la madre un cromosoma X con el alelo ojos rojos presentara el fenotipo de ojos rojos, mientras que las hembras serán todas silvestre (ojos rojos carácter dominante). Por otra parte, algunas veces, aunque no siempre, los fenotipos reflejan el genotipo, según el segundo postulado de Mendel si un organismo posee un gen dominante y uno recesivo, el fenotipo corresponderá a aquel cuya característica sea dominante, enmascarando la presencia del gen recesivo en la generación F1. Para este caso, ya que los genes dominantes corresponden al estado silvestre, el carácter color negro de White Ebony no se va a presentar, considerando que el gen responsable de la mutación Ebony según Linlsleyd (1992), se encuentra ubicado en el cromosoma 3 en la posición 70.7 del genoma de Drosophila melanogaster, se trata de un gen autosómico que se transmite mediante herencia mendeliana y no está ligado a los cromosomas sexuales.

 Generación Filial 2:

F1 x F1 ♀

♂

W+ W Ee

W Ee

Gametos: W+

W

W E

E e

♀

e

W+E

W+e

WE

We

WE

W+WEE

W+ WEe

WWEE

WWEe

We

W+WEe

W+ Wee

WWEe

WWee

W+

W+

W

W

♂

E

EE

Ee

EE

Ee

e



W+

Ee

W+

ee

W

Ee

W

ee

Proporciones: Genotipo: Proporción genotípica: Fenotipo: 6/16 individuos de ojos rojos cuerpo amarillo (3 hembras y 3 machos), 6/16 individuos de ojos blancos cuerpo amarillo (3 hembras y 3 machos), 2/!6 individuos de ojos rojos cuerpo negro (1 hembra y 1 macho), 2/16 individuos de ojos blancos cuerpo negro (1 hembra y 1 macho) Proporción fenotípica: 6:6:2:2

Una vez establecidas las frecuencias esperadas para la segunda generación filial del cruce recíproco se realizó el análisis de X2, considerando la observación de las características fenotípicas de 500 moscas en laboratorio. 



FENOTIPO

Hipótesis nula: Las frecuencias fenotípicas del cruce se ajustan a la proporción fenotípica 6:6:2:2 Hipótesis alternativa: Las frecuencias fenotípicas del cruce difieren de las proporciones 6:6:2:2

Ojos rojos cuerpo amarillo

Ojos blancos cuerpo amarillo

Ojos rojos cuerpo negro

Ojos blancos cuerpo negro

TOTAL

Registro fotográfico

170 Observado s (Ob)

204

Esperados (Es)

187

(Ob-Es)²

289

74

52

500

63

63

500

121