E.coli Lebendkeimzahl PDF

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Ecoli-Lebendkeimzahl...

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Inhalt 1.

Einleitung ............................................................................................................................ 3 1.1

Durchführung und Aufgabenstellung .......................................................................... 4

2. Material und Methoden .......................................................................................................... 4 2.1 Verdünnungsreihe ............................................................................................................ 5 2.2 Oberflächenspatelverfahren.............................................................................................. 5 2.3 Titerbestimmung .............................................................................................................. 5 2.4 Berechnungen für die Auswertung der Gruppenergebnisse ............................................. 6 3.

Ergebnisse ........................................................................................................................... 7 3.1 Auswertung der Gruppenergebnisse ................................................................................ 7 3.2 Auswertung der eigenen Ergebnisse ................................................................................ 9

4.

Diskussion ......................................................................................................................... 11

5.

Zusammenfassung............................................................................................................. 11

6.

Quellen .............................................................................................................................. 13 6.1 Literatur .......................................................................................................................... 13 6.2 Abbildungen ................................................................................................................... 13 6.1

Tabellen ..................................................................................................................... 13

1. Einleitung Die Bestimmung der Keimzahl erfolgt in allen Bereichen, in denen Mikroorganismen (MO) Einfluss auf dessen Objekte haben, wie z.B. in der pharmazeutischen Industrie beim quantitativen Nachweis von Mikroorgansimen [5]. Bei der Keimzahlbestimmung gibt es zwei wesentliche Methoden. Bei der Gesamtkeimzahlbestimmung werden sowohl „tote“ als auch „lebende“ Zellen erfasst. Wobei, wenn man von „lebenden“ Zellen spricht, man teilungsfähige Zellen meint. Nur diese werden bei der Lebendkeimzahlbestimmung erfasst. Bei diesem Verfahren wird die Annahme, dass jede lebende Zelle eine Kolonie bildet ausgenutzt. Weshalb nach dem Ausplattieren einer bestimmten Anzahl an Zellen und nach dem bebrüten, die gewachsenen Kolonien gezählt werden. Aus diesem Grund bezeichnet man dieses Verfahren auch als Platten – oder Koloniezählung. Bei der Lebendkeimzahlbestimmung unterscheidet man

zwischen

dem

Koch`sche

Plattenguss,

dem

Oberflächenspatelverfahren,

der

Membranfiltration und dem MPN-Verfahren [4]. Der einzige Unterschied zwischen dem Oberflächenspatelverfahren und dem Koch`schen Plattengussverfahren besteht darin, dass die Probe beim Koch`schen Plattengussverfahren in einen flüssigen Agar gebracht wird, statt auf der Oberfläche aufgetragen wird. Das Oberflächenspatelverfahren eignet sich hervorragend für aerobe sowie fakultativ anaerobe Mikroorganismen, wohingegen das Koch’sche Plattengussverfahren eher für fakultativ aerobe Mikroorganismen, wie die Hefezellen geeignet ist [1]. Bei beiden Methoden sind eine geeignete Zelldichte und eine gleichmäßige Verteilung der Zellen im oder auf dem Agar wichtig. Weshalb diese immer sinnvoll verdünnt werden sollte, denn es ist fast unmöglich 500 Kolonien auszuzählen. Zusätzlich sollte eine weitere Verdünnung hergestellt werden, da diese am leichtesten auszuzählen ist. Die Lebendkeimzahl berechnet sich aus der Anzahl der Kolonien auf den einzelnen Platten, der eingesetzten Verdünnungsstufe und dem aufgebrachten Probevolumen auf diesen Platten. Der Bakterientiter wird dabei meist als Kolonie-bildende Einheit pro Milliliter (KbE/mL) angegeben: 𝐾𝑏𝐸 𝑚𝐿

=

𝐾𝑜𝑙𝑜𝑛𝑖𝑒𝑛 𝑝𝑟𝑜 𝑃𝑙𝑎𝑡𝑡𝑒 𝑉𝑒𝑟𝑑ü𝑛𝑛𝑔𝑠𝑠𝑡𝑢𝑓𝑒 𝑥 𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 [𝑚𝐿]

[1].

Bei einer Platte mit einer geringen Keimbelastung, wirken sich Zählfehler stärker aus. Bei einer hohen Keimzahl besteht hingehend die Möglichkeit, dass nicht jede teilungsfähige Zelle die Möglichkeit besitzt zu wachsen, da eine Konkurrenz um den Platz auf dem Agar besteht.

Damit die Konkurrenz nicht auch noch zwischen „fremden“ MO entsteht ist es Pflicht aseptisch, sprich keimfrei zu arbeiten. Wenn beim Auszählen der Kolonien Kolonien, die sich in ihrer Morphologie unterscheiden erkennbar sind, deutet die auf eine Kontamination hin. Um den Fehler möglichst gering zu halten und erfahrungsgemäß bessere Ergebnisse zu erzielen wird die Lebendkeimzahl einer Escherichia coli Suspension dreimal bestimmt. Escherichia coli (E.coli) ist ein Bakterium, welches einen wichtigen Bestandteil der Darmflora des Menschen bildet [2],dort bildet es Vitamin K. E.coli ist ein fakultativ anaerobes Bakterium, das heißt es kann ideal in sauerstoffreichen Umgebungen wachsen, aber eben auch in Abwesenheit von Sauerstoff den Stoffwechsel auf anaerobe Atmung wechseln, weshalb die Anwendung des Oberflächenspaltelverfahren zu lässlich ist. Des Weiteren ist E.coli aufgrund seiner dünnen Mureinschicht und der Doppelmembranschicht, zu den Gramm-negativen Bakterien einzuteilen.

1.1 Durchführung und Aufgabenstellung Die Versuchsdurchführung erfolgt wie im Skript „Mikrobiologisches Praktikum I - SS 2019 / 2. Bestimmung der Lebendkeimzahl einer E.coli Suspension“ Seite 18.

2. Material und Methoden Der Versuch wurde an allen drei Versuchstagen wie im Skript „Mikrobiologisches Praktikum I - SS 2019 / 2. Bestimmung der Lebendkeimzahl einer E.coli Suspension“, mit den dort erwähnten Materialen durchgeführt. Die Verdünnungsreihe erfolgte, wie in der Abbildung 2 dargestellt. Danach folgte das Oberflächenspatelverfahren, deren Platten dann ausgezählt wurden und der Titer wurde für die jeweilige Platte bestimmt.

2.1 Verdünnungsreihe

Abb. 2: Schematische Darstellung des Verdünnungsverfahren

2.2 Oberflächenspatelverfahren

Beim Oberflächenspatelverfahren wird 0,1 ml einer Verdünnungsstufe mit einer sterilen Pipette auf eine fertig gegossene Agarplatte aufgebracht. Der Tropfen wird mit einem sterilen Drigalski-Spatel gleichmäßig auf der Platte verteilt. Dann wird die Petrischale mit dem Deckel verschlossen und erst beim Trocknen des Ausstrichs erfolgt das bebrüten der Platte [3].

2.3 Titerbestimmung

Zur Titer Bestimmung für alle drei Versuchstage wird jeweils folgende grundlegende Formel verwendet: 𝐾𝑏𝐸

𝐾𝑜𝑙𝑜𝑛𝑖𝑒𝑛 𝑝𝑟𝑜 𝑃𝑙𝑎𝑡𝑡𝑒

𝑚𝐿 𝑉𝑒𝑟𝑑ü𝑛𝑛𝑔𝑠𝑠𝑡𝑢𝑓𝑒 𝑥 𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 [𝑚𝐿]

2.4 Berechnungen für die Auswertung der Gruppenergebnisse Die Formel in der Abbildung 3 wurde zur Mittelwertbestimmung verwendet. Dies erfolgte, um ein Durchschnittswert zu erhalten, mit dem man weiter rechnen kann.

Abb. 3: Formel zum arithmetischen Mittelwert

Danach wurde mit der Formel der Abbildung 3 die Standardabweichung bestimmt. Die Standardabweichung ist ein Maß dafür, wie weit die einzelnen Zahlen verteilt sind. Genauer gesagt, gibt sie an, wie weit die einzelnen Messwerte im Durchschnitt von dem Erwartungswert, sprich dem Mittelwert entfernt sind [6].

Abb.4: Formel zur Standardabweichung

Mit der dritten Formel wurde der Variationskoeffizient berechnet. Der Variationskoeffizient zeigt die Streuung bezogen auf den Mittelwert an. Je größer der Wert ist, desto größer ist die Streuung, sprich desto größer ist der begangene Fehler [7]. V [%] =

𝑆𝑡𝑎𝑛𝑑𝑎𝑟𝑑𝑎𝑏𝑤𝑒𝑖𝑐ℎ𝑢𝑛𝑔 𝑀𝑖𝑡𝑡𝑒𝑙𝑤𝑒𝑟𝑡

* 100

3. Ergebnisse 3.1 Auswertung der Gruppenergebnisse n.d: nicht definiert

Tabelle 1: Werte der Versuchstage des Kurses A

Gruppe 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6 7 7 7 8 8 9 9 10 10 11 11

t1 in 109 t2 in 109 t3 in 109 KbE/mL KbE/mL KbE/mL Inci 1,4 1,1 2 Val n.d 1,4 1,2 Can 0,8 1,1 1,3 Sina 1,3 1,5 1,1 Vivien 1,2 1,1 1,5 Linh 1,5 1,3 1,1 Lisa 1,3 1,4 1,2 Maria 1,3 1,1 1,2 Robert 0,6 1,1 0,8 Paula 1,8 1,3 0,6 Alaa 0,5 1,2 0,2 Emre 1 1,1 1 Bjarne 1,5 1,5 1,3 Moaiad nd 0,7 0,02 Mu 1,5 1 2,7 Sarah 0,9 1,2 1,2 Nadine 1,8 0,7 1 Rosa 0,5 0,8 0,7 Ani 1,1 1,0 1,0 Vanes 1,1 1 1 Selina 1 1,6 1 Maddy 1 1 1,3 Laura 1,2 1,1 0,9

Student

Mittelwert

1,15

1,14

1,02

Gesamtmittelwert

MW Standardabweichung

0,37

0,23

0,40

MW Gesamt 1,10 Gesamtstandardabweichung

SW

SW Gesamt 0,34

Aus der Tabelle1 lässt sich nun der ideale Titer ableiten, dieser liegt ca. bei 1,1 – 1,3 x 109 KbE/mL. Dieser Wert überschneidet sich auch mit dem, der im Skript erwähnt worden war. Sowie die berechneten Standardabweichungen lassen sich ablesen. Dem Diagramm 1 sind nun die Gesamtergebnisse über die drei Versuchstage entnehmbar.

Gesamtergebnisse 1,4 1,2

109

KbE/mL

1

0,8

MW Gesamt

0,6

SW Gesamt

0,4

MW SW

0,2 0 1

2

3

Versuchstag Diagramm 1: Darstellung der Gesamtergebnisse

Dem Diagramm 2 sind die Werte, zur Erkennung der Arbeitsverbesserung nochmal besser entnehmbar, da hier die Werte in Linien dargestellt wurden.

Graphik zur Erkennung der Arbeitsverbesserung 1,4 1,2 1

KbE/mL

0,6

Gesamt MW

109

Mittwelwert

0,8

0,4

Gesamt SW

SW

0,2 0 Tag 1

Tag 2

Diagramm 2: Graphik zur Erkennung der Arbeitsverbesserung

Tag 3

3.2 Auswertung der eigenen Ergebnisse 1. Versuchstag (30.04.19): Quantitativ-gute Durchführung, da ein gleichmäßiges, dichtes Wachstum der Kolonien über die ganze Platte sowie keine Kontamination erkennbar sind. Titer Berechnung erfolgte bei der 10-6 Verdünnung, da hier die Abweichung zum idealen Titer am geringsten ist, und das Auszählen am besten gelang. Titer der 10-5 Verdünnung: Titer der 10-6 Verdünnung: Titer der 10-7 Verdünnung:

496 10−5 𝑥 0,1 𝑚𝐿 136 10−6 𝑥 0,1 𝑚𝐿 7 10−7 𝑥 0,1 𝑚𝐿

= 4,96 𝑥 108 = 1,36

𝐾𝑏𝐸 𝑚𝐿

𝐾𝑏𝐸 𝑥 109 𝑚𝐿

= 0,7 𝑥109

𝐾𝑏𝐸 𝑚𝐿

2. Versuchstag (07.05.19): Semi-gute Durchführung, da gleichmäßiges, dichtes Wachstum der Kolonien über die ganze Platte erkennbar sind, aber zusätzlich auch eine Kontamination. Es ist ein Pilz gewachsen, was darauf hindeutet, dass die Umgebung unsteril ist, sprich es wurde nicht aseptisch gearbeitet. Titer Berechnung der 10-7 Verdünnung, da diese Platte am besten Auswertbar und die Abweichung zum idealen Titer am geringsten ist. Titer der 10-5 Verdünnung nur schwer auswertbar, aufgrund des dichten Wachstum der Kolonien nebeneinander. Titer der 10-6 Verdünnung: Titer der 10-7 Verdünnung:

93 10−6 𝑥 0,1 𝑚𝐿 11 10−7 𝑥 0,1 𝑚𝐿

= 930 𝑥 106 = 1,1 𝑥109

Abb. 5: Auswertung Lebendkeimzahl am zweiten Versuchstag

𝐾𝑏𝐸 𝑚𝐿

𝐾𝑏𝐸 𝑚𝐿

3. Versuchstag (04.06.19): „Semi-misslungene“ Durchführung: Es ist ein gleichmäßiges, dichtes Wachstum der Kolonien über die ganze Platte, außerdem keine Kontamination erkennbar. Titer Berechnung der 10-6 Verdünnung, da hier die Abweichung zum idealen Titer am geringsten ist. Der zu großer Titer, deutet auf eine fehlerhafte Durchführung hin. Möglicherweise wurde in einem Verdünnungsschritt das Verdünnen vergessen bzw. das Verdünnen erfolgte nicht ideal. Der Titer der 10-5 Verdünnung nicht auswertbar, aufgrund des dichten Wachstumes der Kolonien nebeneinander. Titer der 10-6 Verdünnung: Titer der 10-7 Verdünnung:

201 10−6 𝑥 0,1 𝑚𝐿 36 10−7 𝑥 0,1 𝑚𝐿

= 2,01 𝑥 109 = 3,6 𝑥109

𝐾𝑏𝐸 𝑚𝐿

𝐾𝑏𝐸 𝑚𝐿

Tabelle 2: Tabelle zur Verdeutlichung der eigenen Ergebnisse

t1 in 109 t2 in 109 KbE/mL KbE/mL 1,4 1,1 0,7 0,9 0,4 -

t3 in 109 Mittelwert Standardabweichung Variationskoeffizient KbE/mL 109 KbE/mL [%] 2 1,5 0,4 26,6 3,6 1,7 1,6 94,1 -

Der Tabelle 2 ist zu entnehmen, dass die Wahl des Titers korrekt war, da somit die Abweichungen

am

geringsten

sind.

Dies

ist

unteranderem

dem

Wert

des

Variationskoeffizienten am besten entnehmbar, da dieser Wert eine große Steuerung und somit einen großen Fehler anzeigt.

4. Diskussion Zur individuellen Auswertung ist zu sagen, dass die erzielten Lebendkeimzahlen der E.coli Suspension an fast allen Versuchstagen im Ideal-Bereich liegen. Die leichten Abweichungen der berechneten Titer zum idealen Titer lassen zumuten, dass relativ gleichmäßig gearbeitet wurde, da große Abweichungen auf Fehler hindeuten würden. Am letzten Versuchstag ist, aufgrund der großen Abweichung entnehmbar, dass ein Fehler unterlaufen ist. Höchstwahrscheinlich wurde in einem Schritt der Verdünnungsreihe das verdünnen vergessen bzw. fehlerhaft durchgeführt, wodurch dann beim ausplattieren eine zu große Menge von teilungsfähigen E.coli Zellen die Möglichkeit hatten auf dem Agar zu wachsen. Dieser Ausreißer-Wert zieht den Mittelwert, sowie die Standardabweichung in die Höhe. Der Wert des Variationskoeffizient verdeutlicht dies nochmal. Der Wert von 26, 6 % deutet auf eine größere Streuung, sprich einen Fehler hin. Zu der weiteren Arbeitsweise lässt sich sagen, dass ziemlich aseptisch gearbeitet wurde, da nur eine der Agarplatten aus den Versuchen eine Kontamination besaß. Um nun die Gruppenergebnisse auszuwerten wurden mehrere Graphiken erstellt, die die Arbeitsweise des gesamten Kurses wiederspiegeln. Im Allgemeinen kann man sagen, dass die Werte des gesamten Kurses auf ein genaues Arbeiten hindeuten, denn nimmt man einen Richtwert von ca. 100 Kolonien (laut Skript), weist der Mittelwert vom ersten und zweiten Versuchstag auf genaues Arbeiten des Kurses hin, da diese Werte nur minimal von Gesamtmittelwert abweichen. Tendenziell lässt sich sagen, dass die besten Ergebnisse am ersten und zweiten Versuchstag erzielt wurden.

5. Zusammenfassung Resümierend kann man sagen, dass die erzielten Ergebnisse einen staunen lassen, da am ersten und am zweiten Versuchstag die besten Ergebnisse erzielt wurden. Dies ist aber widersprüchlich zu der Theorie, dass sich die Qualität bei wiederholenden Durchgängen verbessert. Aber auch Fehler die als Ausreißer gelten, wie mein Ergebnis für Versuchstag 3 sorgen dafür, dass sich die gesamten Ergebnisse ändern und sich somit die Standardabweichung erhört. Dieser Effekt kann man den beiden Graphiken gut entnehmen. Vorteile des Oberflächenspatelverfahrens sind das einfache und schnelle Arbeiten, sowie die Möglichkeit der schnellen Auswertung aufgrund der schnellen Auszählung der Kolonien auf dem Agar. Ein weiter Vorteil ist, dass die Kultivierung von aeroben sowie fakultativ anaeroben

Mikroorganismen möglich ist. Im Gegensatz zum Koch`schen Plattengussverfahren ist hier eine gute Kontaminationskontrolle möglich. Das allgemeine Ziel dieses Versuches war die LKZ-Bestimmung einer E.coli Suspension. Ein positiver Nebeneffekt war das Erlernen von Grundlagen des mikrobiologischen Labors, die uns auch bei den praktischen Prüfungen begegnen.

6. Quellen 6.1 Literatur •

[1] Skript „Mikrobiologisches Praktikum I - SS 2019 / 2. Bestimmung der Lebendkeimzahl einer E.coli Suspension“

•

[2] https://mobil.bfr.bund.de/de/escherichia_coli-54352.html (Zugriff am 04.06.2019)

•

[3] https://www.univie.ac.at/hygiene-aktuell/UE2.pdf (Zugriff am 04.06.2019)

•

[4] Vorlesungsfolien zum Thema: Bestimmung der Lebendkeimzahl einer E. coli-Suspension, Dr. Ute Schöber SS 2019

•

[5] http://www.loesungsfabrik.de/ (Zugriff am 07.04.2019)

•

[6] https://matheguru.com/stochastik/standardabweichung.html (Zugriff am 07.04.2019)

•

[7] https://welt-der-bwl.de/Variationskoeffizient (Zugriff am 07.04.2019)

6.2 Abbildungen •

Abb. 1: mikroskopische Darstellung von E.coli

Quelle: https://www.biocote.com/wp-content/uploads/2016/07/Five-Facts-about-E-coli_img.jpg •

Abb. 2: Schematische Darstellung des Verdünnungsverfahren

Quelle: Skript „Mikrobiologisches Praktikum I - SS 2019 / 2. Bestimmung der Lebendkeimzahl einer E.coli Suspension“ •

Abb.3: Formel zum arithmetischen Mittelwert

Quelle: https://www.sixsigmablackbelt.de/median-mittelwert/ (Zugriff am 07.06.2019) • Abb. 4: Formel zur Standardabweichung Quelle: https://www.lecturio.de/magazin/excel-standardabweichung/ (Zugriff am 07.04.2019) •

Abb. 5 Auswertung Lebendkeimzahl am zweiten Versuchstag Quelle: eigenes Bild

• •

Diagramm 1: Darstellung der Gesamtergebnisse Diagramm 2: Graphik zur Erkennung der Arbeitsverbesserung

Alle Diagramme wurden von mir selbst aus den Werten der Versuchstage erstellt. Sie wurden mit dem Programm „Excel“ erstellt.

6.1 Tabellen 1. 2.

Tabelle 1: Werte der Versuchstage des Kurses A Tabelle 2: Tabelle zur Verdeutlichung der eigenen Ergebnisse...