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Ensayo sobre electroferograma...

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ELECTROFEROGRAMA

El electroforegrama (electroforegrama) consiste en separar una muestra de mezcla (como suero) en el medio de soporte en zonas mediante electroforesis . Sin embargo, la tira de electroforesis debe teñirse para mostrar la zona para obtener el patrón de electroforesis. También es posible escanear más en el densitómetro para obtener un patrón de grabación. Principios básicos de electroforesis. El fenómeno de que las partículas cargadas se mueven hacia electrodos opuestos a sus propiedades eléctricas bajo la acción de un campo eléctrico se llama electroforesis . Las partículas cargadas en un campo eléctrico diferente de la velocidad de movimiento, mezcla técnica de los componentes para la separación,

purificación

y

el

ensayo

se

refiere

a una

técnica

electroforética arte . Las muestras separables pueden ser proteínas de molécula grande, polisacáridos, ácidos nucleicos o aminoácidos de molécula pequeña, nucleósidos, etc. Los métodos de electroforesis varían mucho. Sin embargo, el principio básico es el mismo, es decir, la diferencia en las propiedades cargadas y las cargas de las diversas moléculas en la muestra que se separan al mismo pH, así como el tamaño y la forma de las moléculas

mismas, de modo que las moléculas cargadas producen diferentes velocidades de migración en el campo eléctrico, logrando así Separación, identificación o purificación de muestras. Clasificación de la electroforesis. Los diferentes tipos de métodos de implementación de electroforesis y claves técnicas son diferentes y complicados: no existe un sistema de clasificación que pueda cubrir todos los métodos de electroforesis sin duplicación. El método de clasificación sistemática que considera de manera integral factores como el tipo de soporte, el principio de electroforesis y el uso es simple y claro, y los principales tipos de electroforesis pueden encontrar su lugar en el sistema. Según si se utiliza el soporte: Electroforesis sin soporte. Este tipo de electroforesis también se llama electroforesis libre. El método de electroforesis consiste en disolver directamente la muestra a analizar en una solución tampón adecuada y energizar los dos extremos de la solución tampón para formar un campo eléctrico, y las partículas punteadas nadan libremente en

la

solución

para

lograr

el

efecto

de

separación. Incluyendo

microelectroforesis de Tise-leas, microelectroforesis, electroforesis de enfoque

isoeléctrico, electroforesis isocinética y electroforesis en gradiente de densidad. El desarrollo de la electroforesis libre es relativamente lento debido a la estructura complicada, el gran volumen, los estrictos requisitos de operación y el alto precio del aparato de electroforesis. A menudo, la electroforesis libre solo se selecciona cuando otras técnicas son difíciles de cumplir con los requisitos de análisis y separación.Por ejemplo, la electroforesis de enfoque isoeléctrico es un método insustituible para medir con precisión el punto isoeléctrico de las proteínas. Tecnología de electroforesis compatible El método de electroforesis es seleccionar materiales apropiados como papel de filtro y gel como soporte, sumergir ambos extremos o todo el soporte en la solución tampón y lograr el equilibrio del sistema tampón, agregar una muestra al soporte y aplicar voltaje a ambos extremos de la solución tampón para

formar

un

campo

eléctrico.

Para

lograr

el

efecto

de

electroforesis. Factores como la naturaleza de las partículas punteadas y el tamaño del diámetro del soporte determinan la posición final de la natación. Los resultados de la electroforesis muestran que los diferentes componentes forman zonas separadas, por lo que este tipo de electroforesis también se denomina electroforesis de zona , incluida la electroforesis de papel, la electroforesis de película de acetato de celulosa, la electroforesis de

capa fina y la electroforesis en polvo (los soportes son: almidón, polvo de celulosa, vidrio Polvo, etc.), electroforesis en gel (gel de poliacrilo, gel de sílice, gel de agar (azúcar)). La electroforesis de zona tiene muchos tipos y es ampliamente utilizada.El rápido desarrollo es uno de los puntos calientes en la tecnología de bioanálisis. La electroforesis de zona se divide de acuerdo con el dispositivo de soporte y la dirección de la electroforesis. (1) Electroforesis de placa plana: el dispositivo es una placa de vidrio y electroforesis en dirección horizontal. (2) Electroforesis en columna vertical: el dispositivo es un tubo de vidrio, y electroforesis en dirección vertical. (3) Electroforesis en placa vertical: el dispositivo es una placa de vidrio y electroforesis en dirección vertical. (4) Electroforesis de zona capilar: utilizando capilar como canal de separación. Movilidad electroforética y factores influyentes. Movilidad electroforética

Las partículas cargadas se separan durante la electroforesis, dependiendo de la velocidad a la que las diferentes partículas nadan bajo la misma intensidad de campo eléctrico. La velocidad de movimiento de las partículas cargadas en un campo eléctrico se expresa mediante la movilidad (o movilidad, μ). La movilidad se define como la velocidad de nado de partículas cargadas a una unidad de intensidad de campo eléctrico.

En la formula 1

Es la movilidad; v es la velocidad de movimiento de las partículas cargadas; E es la intensidad del campo eléctrico. La velocidad de nado de partículas cargadas en un campo eléctrico está determinada por un par de fuerzas opuestas: fuerza y resistencia del campo eléctrico. entre ellos

En la fórmula 2, F-fuerza del campo eléctrico (Newton); q-carga neta de iones (coulomb); E-fuerza del campo eléctrico (voltios / metro): en la fórmula 3

-Resistencia (Newton); radio de partículas r (m);

—— Viscosidad media (Newton · seg / m2 ). Cuando estas dos fuerzas son iguales, la velocidad de natación es constante, proporcional a F, y

Inversamente proporcional. cual es

La fórmula anterior se puede resolver:

Se puede ver en la Ecuación 5: la velocidad de las partículas cargadas que nadan en el campo eléctrico es proporcional a la intensidad del campo eléctrico y la carga neta de las partículas cargadas, pero inversamente proporcional al radio de la partícula y la viscosidad del medio.

Factores principales que afectan la electroforesis La diferencia en la movilidad de las partículas cargadas es la base de la separación electroforética, por lo que todos los factores que afectan la movilidad son factores que afectan la electroforesis. Como se puede ver en la Ecuación 5, estos factores incluyen la naturaleza de las partículas cargadas, así como las condiciones del sistema de electroforesis, e incluso los principales factores que influyen en los diferentes tipos de electroforesis son diferentes. Lo siguiente discute brevemente estas condiciones. 1) Propiedades de partículas cargadas La cantidad de carga estática, el tamaño de partícula y la forma que llevan las partículas cargadas tienen un efecto significativo en la velocidad de natación. En general, cuanto mayor es la carga neta de una partícula, menor es el diámetro y cuanto más se acerca la forma a una esfera, mayor es su velocidad de nado en el campo eléctrico; de lo contrario, más lenta es. 2) Campo eléctrico fuerza La intensidad del campo eléctrico es la caída potencial por centímetro, también llamada gradiente potencial. Se puede ver en la ecuación 1 que cuanto mayor es la intensidad del campo eléctrico, más rápida es la velocidad de la electroforesis. Por el contrario, el más lento. Según la intensidad del campo

eléctrico, la electroforesis se puede dividir en electroforesis de presión normal y electroforesis de alto voltaje. La intensidad del campo eléctrico del primero es de 2 ~ 10V / cm, el último es de 20 ~ 00V / cm. Se necesita menos tiempo para separar las muestras por electroforesis a alta presión que la electroforesis a presión atmosférica. Cabe señalar que no es que cuanto mayor es la intensidad del campo eléctrico, más favorable es para la separación electroforética. A medida que aumenta la intensidad del campo eléctrico, aumenta la intensidad de corriente a través del medio, lo que hará que aumente el calor generado por el proceso de electroforesis, lo que afectará el efecto de electroforesis. 3) Propiedades del sistema de almacenamiento intermedio (1) valor de PH El pH del tampón determina el grado de disociación de las partículas cargadas y la cantidad de carga neta. La velocidad de la electroforesis, por lo tanto, se ve muy afectada. Para las moléculas anfóteras, el valor del pH también determina las propiedades eléctricas de las partículas cargadas, lo que a su vez afecta la dirección de su electroforesis. En términos generales, cuanto más lejos esté el valor de pH del tampón del punto isoeléctrico de la molécula

anfifílica, cuanto mayor sea la carga neta, mayor será la velocidad de natación. Por el contrario, el más lento. (2) fuerza iónica La fuerza iónica del tampón generalmente se mantiene entre 0,02 y 0,2. Si la fuerza iónica es demasiado baja, la capacidad de amortiguación del sistema es pobre, y la estabilidad de la velocidad de natación a menudo se ve afectada por el cambio en el valor de pH de la solución durante la electroforesis. Si la fuerza iónica es demasiado alta, la velocidad de nado de las partículas se reducirá debido a la atracción electrostática. (3) Viscosidad Se puede ver en la Ecuación 5 que la viscosidad de la solución del sistema tampón es inversamente proporcional a la movilidad. Por lo tanto, cuanto mayor es la viscosidad de la solución, menor es la velocidad de electroforesis y viceversa. 4) Electroosmosis La electroosmosis se refiere al movimiento relativo del líquido a un soporte sólido en un campo eléctrico.Si la superficie del papel de filtro está cargada negativamente, la capa de agua cargada positivamente se moverá hacia el electrodo negativo. Cuando el soporte no es absolutamente inerte,

coexisten la electroosmosis y la electroforesis. Cuando la dirección de la electroosmosis y la electroforesis son consistentes, ocurrirá una situación similar a nadar en el viento, acelerando la electroforesis; de lo contrario, la velocidad de natación de las partículas se reducirá. 5) Fiebre de Joule El calor liberado durante la electroforesis es proporcional al cuadrado de la corriente. Cuando aumenta la intensidad del campo eléctrico o aumenta la intensidad iónica en el tampón del electrodo, la corriente aumentará en consecuencia. Si el sistema de disipación de calor no puede satisfacer las necesidades, la temperatura del sistema de electroforesis aumentará considerablemente. Esto no solo reduce la resolución, sino que en casos graves puede quemar el papel de filtro o derretir el soporte de gel de agarosa. 6) Soporte de tamaño de malla de medios El tamaño de la malla del medio de soporte depende de la naturaleza y concentración del medio de soporte. Durante el experimento, el tamaño de la malla debe seleccionarse cuidadosamente de acuerdo con el propósito del análisis de electroforesis y la separación. En el medio con malla grande, la velocidad de electroforesis es rápida y la resolución es baja. De lo contrario, la velocidad de natación es lenta y la resolución es alta.

Instrumentos de electroforesis de uso común. Dispositivo de electroforesis manual 1) Tanque de electroforesis El tanque de electroforesis es la parte central del sistema de electroforesis. Generalmente está compuesto por un tanque principal equipado con electrodos de alambre de platino y un soporte de cámara de pegamento. El tanque principal se llena con solución tampón, y los polos positivo y negativo de la fuente de alimentación están conectados; el soporte de electroforesis se coloca en el soporte de la habitación de pegamento, que está en contacto con la solución tampón del electrodo del tanque principal o directamente sumergido en la solución tampón. Según el diseño experimental, se puede dividir en un tanque de electroforesis en tubo, un tanque de electroforesis de placa vertical, un tanque de electroforesis de placa horizontal y otros tipos.

Figura 2 Tanque de electroforesis de placa

vertical

Figura 3 Tanque de electroforesis de placa

plana

2) fuente de alimentación El papel de la fuente de alimentación es establecer un campo eléctrico electroforético. El campo eléctrico está relacionado con el voltaje, y generalmente se puede dividir en: electroforesis de presión normal: 100 ~ 500V, intensidad de campo 1 ~ 10V / cm, mayor tiempo de separación; electroforesis de alto voltaje: 500 ~ 10kV, intensidad de campo 20 ~ 200V / cm, tiempo de separación corto . Según las características de la potencia de salida, la fuente de alimentación se puede dividir en tres tipos: corriente constante, voltaje constante y potencia constante. 3) Sistema de temperatura constante de circulación externa. El alto voltaje generará un alto calor y debe enfriarse. La electroforesis a presión atmosférica generalmente solo necesita conectar el tubo de agua de

condensado equipado en el tanque de electroforesis al agua del grifo, y conectar el tubo descendente al tanque de agua del laboratorio. La electroforesis con alta presión o condiciones de separación severas requiere un sistema especial de temperatura constante de circulación externa. 4) Dispositivo de análisis de zonas de electroforesis. Después de la separación electroforética, la zona electroforética se corta y luego se eluye con el eluyente, y la concentración de cada componente de la zona se puede determinar con un espectrofotómetro. También se puede usar un sistema de análisis de imágenes de gel para escanear directamente la densidad de la zona electroforética para obtener el porcentaje relativo, y se puede dibujar un gráfico para calcular el área relativa. Analizador automático de electroforesis. Desde la llegada de la tecnología de electroforesis, la optimización del efecto y la simplificación de la operación es la búsqueda incesante de los investigadores científicos. Con el desarrollo y el progreso de la tecnología de electroforesis, varios instrumentos avanzados de electroforesis han surgido continuamente: desde 1990, Pharmacia LKB, Sebia, Francia y Helena, etc. han lanzado sistemas automáticos de electroforesis. La siguiente es la proteína de plasma automática SPIFE3000 de Helena, la electroforesis de

inmunofijación sérica (IFE), la fosfatasa alcalina, la proteína de orina, el colesterol, la lactato deshidrogenasa, etc .: el sistema consta de una computadora, escáner, impresora y host. El operador programa previamente los parámetros como el número de muestras, las propiedades del gel y el tiempo de electroforesis en el programa según sea necesario. El sistema puede completar automáticamente las operaciones de manchado, electroforesis, reactivos de vertido y manchado, tinción, fijación, decoloración y secado, y puede escanear automáticamente Para completar el análisis de resultados y resultados. Electroforesis de zona La electroforesis de zona es la electroforesis con un medio de soporte. Los componentes de la muestra se separan en varias zonas en el medio de soporte. Es el método de electroforesis más utilizado en el campo de las pruebas biológicas. La electroforesis de zona tiene diferentes valores de aplicación en la práctica de la investigación científica debido a los diferentes tipos de medios de soporte y métodos de electroforesis utilizados.Las condiciones de electroforesis y la elección de los medios son las claves para el éxito o el fracaso de la electroforesis. Principios básicos de la electroforesis de zona.

La electroforesis en banda se usa comúnmente para separar y analizar macromoléculas biológicas como el ADN y las proteínas. Seleccione un valor de pH apropiado, de modo que pH> pl, los componentes que se separarán se cargarán negativamente y se moverán al electrodo positivo. Su movilidad es el resultado integral de varios factores que influyen, como la acción del campo eléctrico, las propiedades de los componentes a medir y la adsorción del medio en fase sólida. Después de la electroforesis, el medio con los componentes a

analizar

se

sumerge

en un

tinte

apropiado

para

combinarlos.Después del secado, se escanea el densitómetro y se calcula el contenido de cada componente en función del resultado de integración de cada área de pico. Selección de medios de electroforesis de zona. La electroforesis de zona es un medio para lograr la separación por las partículas cargadas que nadan en el medio electroforético. La elección del medio electroforético afecta en gran medida los resultados de la electroforesis. Al seleccionar un medio de gel, generalmente es necesario considerar

exhaustivamente

los

factores

que

afectan

la

movilidad

electroforética, la viabilidad técnica, la optimización de recursos y las propiedades de los componentes que se probarán. Los medios de uso común incluyen lo siguiente:

(1) papel de filtro Al comienzo del desarrollo de la electroforesis de zona, se utilizó papel de filtro húmedo como medio electroforético. Posteriormente, apareció la tecnología de cromatografía en papel, y la combinación de electroforesis y tecnología de cromatografía expandió enormemente el rango de aplicación de la electroforesis en papel de filtro. La electroforesis en papel tiene las ventajas de un equipo simple y una operación conveniente. También hay desventajas como la electroosmosis severa, el tiempo de operación prolongado y la resolución deficiente. Ha sido reemplazado gradualmente por muchos materiales nuevos. (2) membrana de acetato de celulosa El acetato de celulosa es el acetato de celulosa formado por acetilación de grupos hidroxilo de celulosa. La membrana de acetato de celulosa tiene muy poco efecto de adsorción en las muestras de proteínas, lo que es útil para evitar el fenómeno de "colas" y es uno de los medios comunes para la electroforesis de proteínas. La membrana de acetato de celulosa tiene una baja absorción de agua, lo que conduce a ahorrar solución tampón y acelerar la velocidad de la electroforesis. El patrón de electroforesis de la membrana de acetato de celulosa se trata con una solución transparente para hacer que la

membrana sea transparente, lo que es beneficioso para la medición y el almacenamiento a largo plazo. La desventaja es que tiene un efecto electroosmótico. (3) gel de agarosa El componente principal de la agarosa es un polisacárido lineal, que se puede disolver en agua calentándolo en un microondas o en un baño de agua. Después de enfriar, depende de las cadenas secundarias entre las cadenas de azúcar como los enlaces de hidrógeno para mantener la estructura de la red. La densidad de la estructura de la red y la agarosa Concentración. La agarosa es altamente hidrofílica y no contiene grupos cargados, lo que reduce en gran medida la desnaturalización y la adsorción de la muestra a analizar. Utilizado principalmente para el análisis de ácido nucleico. (4) Poliacrilamida La poliacrilamida es un gel de red cruzada formado mediante la mezcla de un monómero de acrilamida y un agente de reticulación de metilen bisacrilamida en una determinada proporción y se polimeriza bajo la acción de un catalizador (como el persulfato de amonio) para producir un efecto de tamiz molecular. El tamaño de poro del gel puede controlarse mediante la concentración y el grado de reticulación utilizado durante la preparación. La

ventaja del gel de poliacrilamida es que tiene las funciones de medio de electroforesis y tamiz molecular, lo que mejora enormemente la capacidad de separación y es el medio de elect...