Elektroforesis SDS-PAGE PDF

Preview

Summary

LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA DAN ANALISIS PANGAN ELEKTROFORESIS SDS-PAGE NAMA : WAHYU ERWIN FIRMANSYAH NIM : 125100101111014 KELOMPOK : J3 KELAS :J ASISTEN : ISMI PROGRAM STUDI ILMU DAN TEKNOLOGI PANGAN JURUSAN TEKNOLOGI HASIL PERTANIAN FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN UNIVERSITAS BRAWIJAYA MALANG 2014 Wa...

Description

LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA DAN ANALISIS PANGAN ELEKTROFORESIS SDS-PAGE

NAMA NIM KELOMPOK KELAS ASISTEN

: WAHYU ERWIN FIRMANSYAH : 125100101111014 : J3 :J : ISMI

PROGRAM STUDI ILMU DAN TEKNOLOGI PANGAN JURUSAN TEKNOLOGI HASIL PERTANIAN FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN UNIVERSITAS BRAWIJAYA MALANG 2014

Wahyu Erwin Firmansyah THP-FTP-UB-2014

BAB IX ELEKTROFORESIS SDS-PAGE A. Pre-lab 1. Apa yang dimaksud elektroforesis ? Elektroforesis adalah sebuah metode untuk separasi atau pemisahan sebuah molekul besar (seperti protein, fragmen DNA, RNA dll) dari campuran molekul yang serupa. Elektroforesis digunakan untuk memisahkan komponen atau molekul bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik. Sebuah arus listrik dilewatkan melalui medium yang mengandung sampel yang akan dipisahkan. Teknik ini dapat digunakan dengan memanfaatkan muatan listrik yang ada pada makromolekul, misalnya DNA yang bermuatan negatif. Jika molekul yang bermuatan negatif dilewatkan melalui suatu medium (misal agarosa), maka molekul tersebut akan bergerak dari muatan negatif menuju muatan positif. Kecepatan gerak molekul tersebut tergantung pada rasio muatan terhadap massanya dan bentuk molekulnya (Yuwono, 2008). 2. Ada berapa jenis elektroforesis ? Jelaskan masing-masing! Ada 2 jenis elektroforesis yaitu Elektroforesis Kertas dan Elektroforesis Gel.

 Elektroforesis Kertas: merupakan jenis elektroforesis yang terdiri dari kertas sebagai fase diam dan partikel bermuatan yang terlarut (terutama ion-ion kompleks) sebagai fase gerak. Pemisahan tersebut terjadi karena adanya gradasi konsentrasi sepanjang sistem pemisahan. Pergerakan partikel dalam kertas tergantung pada muatan atau valensi zat terlarut, luas penampang, tegangan yang digunakan, konsentrasi elektrolit, kekuatan ion, pH, viskositas, dan daya absopsi zat terlarut (Boyer, 2004).

 Elektroforesis Gel: merupakan elektroforesis yang menggunakan gel sebagai fase diam untuk memisahkan molekul-molekul seperti DNA dan protein menjadi pita-pita yang masing-masing terdiri atas molekul-molekul dengan panjang yang sama. Elektroforesis gel merupakan teknik memisahkan suatu makromolekul dengan cara memberi gaya pada makromolekul tersebut untuk melewati medium berisi gel yang dibantu dengan tenaga listrik. Elektroforesis gel memisahkan berdasarkan laju perpindahannya melewati suatu gel di bawah pengaruh medan listrik. Media atau gel yang dapat digunakan yaitu agarose gel (elektroforesis DNA) dan poliakrilamid gel (elektroforesis protein). Laju pergerakan molekul dipengaruhi oleh ukuran molekul, konsentrasi gel, bentuk molekul, densitas muatan, pori-pori gel, voltase, dan larutan buffer elektroforesis (Martin, 2006).

1

Wahyu Erwin Firmansyah THP-FTP-UB-2014 3. Apa fungsi SDS pada metode SDS-PAGE ? SDS (sodium dodecyl sulfat) merupakan detergen anionik, yang apabila dilarutkan molekulnya memiliki muatan negatif dalam range pH yang luas. Fungsi utama SDS pada metode SDS-PAGE (SDS-Polyacrylamide gel electrophoresis) yaitu untuk memberikan muatan negatif pada protein yang akan dianalisis, selain itu SDS dapat mendenaturasi protein, mempermudah menyamakan kondisi, dan menyederhanakan protein (bentuk, ukuran, dan muatan). Muatan negatif SDS akan menghancurkan sebagian stuktur kompleks protein dan secara kuat tertarik ke arah anoda bila ditempatkan pada suatu medan listrik (Anam, 2009). 4. Apa fungsi akrilamid pada metode SDS-PAGE? Fungsi akrilamid pada metode SDS-PAGE yaitu untuk mencegah difusi akibat timbulnya panas pada arus listrik. Selain itu gel akrilamid sering dimanfaatkan untuk memisahkan molekul protein yang kecil. Konsentrasi akrilamid total dalam gel dapat mempengaruhi

migrasi

protein.

Pada

proses

pembuatan

gel,

akrilamid

akan

berpolimerisasi secara spontan bila tidak ada oksigen (Prihanto, 2011). 5. Apa tujuan analisis protein dengan metode elektroforesis? Tujuan analisis protein dengan metode elektroforesis yaitu untuk memisahkan protein berdasarkan berat molekul dengan menggunakan matriks penyangga akrilamid. Selain itu dengan elektroforesis akan diketahui jenis protein dalam bahan atau sampel yang akan dianalisis. Elektroforesis dalam skala besar memungkinkan digunakan sebagai metode pemisahan untuk menentukan komponen dari protein (Wibowo, 2010). 6. Mengapa protein-protein tersebut dapat terpisah? Protein-protein tersebut dapat terpisah karena adanya proses separasi pada protein memisahkan molekul-molekul protein menjadi pita-pita yang masing-masing terdiri atas molekul protein dengan panjang yang sama. Protein dapat terpisah dengan cara memberi gaya pada protein tersebut untuk melewati medium berisi gel (poliakrilamid) yang dibantu dengan adanya listrik. Protein yang bermuatan listrik ditempatkan pada medium berisi tenaga listrik. Molekul-molekul dari protein akan bermigrasi menuju kutub positif atau kutub negatif berdasarkan muatan yang terkandung di dalamnya. Pemisahan molekul protein berdasarkan pada tingkat migrasi dan berat molekulnya dalam sebuah medan listrik (Wibowo, 2010).

2

Wahyu Erwin Firmansyah THP-FTP-UB-2014 7. Bagaimana cara mengatur ukuran pori gel ? Cara mengatur ukuran pori gel yaitu bergantung pada konsentrasi gel akrilamid yang akan digunakan dan cros-linker (bis). Semakin tinggi konsentrasi akrilamid maka diameter pori-pori di dalam gel akan semakin kecil, sebaliknya jika konsentrasi akrilamid rendah maka diameter pori-pori di dalam gel akan semakin besar. Apabila protein berukuran besar atau memiliki berat molekul yang besar, maka memerlukan gel dengan konsentrasi akrilamid yang kecil, dengan demikian ukuran pori di dalam gel akan besar (Prihanto, 2011). 8. Apa yang dimaksud dengan stacking gel? Mengapa stacking gel diperlukan? Stacking gel merupakan salah satu gel yang digunakan dalam SDS-PAGE. Stacking gel merupakan gel pengumpul atau gel penimbun yang terletak pada bagian atas. Stacking gel dibuat dengan campuran antara akrilamid 30%, Tris HCl 1 M pH 6,8, steril aquades, SDS 10%, Ammonium Phosphate (APS) 10%, dan temed (Utami, 2007). Stacking gel diperlukan dalam elektroforesis protein karena digunakan untuk mencetak sumuran (well), selain itu digunakan untuk menimbun atau memekatkan protein menjadi satu jalur yang sempit sebelum protein itu memasuki gel pemisah. Stacking gel juga digunakan untuk menahan sementara agar sampel bermigrasi pada waktu yang bersamaan. Pada saat elekroforesis protein, protein akan tertarik ke bagian bawah arus listrik. Protein yang memiliki berat molekul paling kecil bergerak cepat sehingga tertarik sampai bagian bawah gel, sedangkan protein yang memiliki berat molekul paling besar akan berada pada bagian atas dari gel (Utami, 2007). 9. Apa fungsi pewarnaan gel pada metode elektroforesis ? Pewarnaan atau staining pada gel merupakan bagian dari metode SDS-PAGE. Fungsi pewarnaan gel pada elektroforesis yaitu untuk membantu memonitor jalannya elektroforesis. Pewarnaan gel pada metode elektroforesis protein terdiri dari commasie blue staining dan silver salt staining. Pada pengecatan dengan menggunakan perak nitrat dianalisa jarak migrasi pita-pita protein terbentuk pada gel pemisah. Jarak migrasi diukur dan dibandingkan dengan jarak yang ditempuh oleh pewarna biru bromofenol. Sedangkan pewarna biru bromofenol untuk mengamati migrasi molekul protein selama elektroforesis (Anam, 2009).

3

Wahyu Erwin Firmansyah THP-FTP-UB-2014 B. Diagram Alir Elektroforesis 1. Pembuatan gel Aquades 1700 micro liter 30% akrilamid

LGB 1300 micro liter Dimasukan beaker glass dan diaduk

TEMED 3 ml

APS 10% 35 micro liter

Diaduk hingga tercampur Dituang pada cetakan gel dengan mikropipet tinggi tertentu Dituang aquades dengan mikropipet pada permukaan gel Dibiarkan 15-30 menit pada suhu ruang Dibuang aquades dengan tissue

Hasil

2. Persiapan sampel

Sampel

Dilarutkan dalam sampel buffer Dipanaskan suhu 90oC, 5 menit Hasil

4

Wahyu Erwin Firmansyah THP-FTP-UB-2014 3. Pemisahan protein dengan elektroforesis Aquades 1475 micro liter UGB 625 micro liter 30% akrilamid 400 Dimasukkan beaker glass dan diaduk microliter APS 10% 20 micro liter TEMED 4 micro liter Diaduk hingga tercampur Dituang gel pemisah

Disiapkan gigi sisir pada stacking gel jangan sampai ada gelembung Gel dibiarkan terpolimerisasi 15-30 menit pada suhu ruang Sisir diambil secara perlahan dari gel Gel dipindahkan ke elektroforensis Dimasukkan buffer ke tank elektroforensis Hasil

4. Pewarnaan gel 10 ml sampel

Dimasukkan dalam sumuran

Dipasang elektroda sesuai warna

Gel dipisahkan pada tegangan 200 V, 60 menit Hasil 5

Wahyu Erwin Firmansyah THP-FTP-UB-2014

Arus Listrik Dipisahkan gel dari tank Dipindahkan glass plate dari gel kedua sisi Dituang larutan pewarna gel dalam wadah Ditutup dengan plastik dan letakkan shacker 5-30 menit Dimasukkan ke penghilang warna Dipindahkan larutan pewarna dari gel, bilas aquades Dituangkan larutan pembilas

Potongan kertas saring

Dibiarkan 15-30 menit Diganti larutan pembilas dengan yang baru hingga terbentuk pita proton pada gel

Hasil

6

Wahyu Erwin Firmansyah THP-FTP-UB-2014 C. Hasil dan Pembahasan Data Hasil Pengamatan Protein Marker

BM (KDa)

Panjang Pita (cm)

Log (BM)

RF

I

225

2,3

2,352

0,479

II

150

2,6

2,176

0,542

III

100

2,9

2

0,604

IV

75

3,5

1,875

0,729

V

50

4,1

1,698

0,854

VI

35

VII

25

Perhitungan Panjang separating gel = 4,8 cm Panjang pita sampel = 3,2 cm RF(sampel)=

=

RFI =

=

RFII =

=

RFIII =

=

RFIV =

=

RFV =

=

, ,

, ,

= 0,667

= 0,479 , ,

, ,

= 0,542 , ,

, ,

= 0,604 = 0,729 = 0,854

7

Wahyu Erwin Firmansyah THP-FTP-UB-2014 Kurva Log BM

RF(sampel) = x y = -1,6552x + 3,0822

y = log BM

y = -1,6552(0,677) + 3,0822

BM = anti log y

y = -1,104 + 3,0822

BM = anti log 1,978

y = 1,978

BM = 95,060 KDa

Gambar Gel SDS-PAGE

Prinsip Elektroforesis Prinsip

yang

digunakan

pada

elektroforesis

yaitu

memisahkan

protein

berdasarkan berat molekul dengan menggunakan matriks penyangga akrilamid. Protein terseparasi dalam medan listrik dilanjutkan dengan pewarnaan, penghilangan warna dan pembilasan gel. Pembacaan berat molekul dapat dilakukan dengan melihat pita yang terbentuk oleh marker. 8

Wahyu Erwin Firmansyah THP-FTP-UB-2014 Rumus Elektroforesis RF (Retention Factor) RF = y = ax + b

x = RF ;

y = log BM

Analisis Prosedur Elektroforesis Pada percobaan Elektroforesis SDS-PAGE, alat yang digunakan antara lain: seperangkat alat elektroforesis, kaca load, comb (sisir), mikropipet, mikrotip, beaker glass, timbangan analitik, spatula, tube elektroforesis, kompor listrik, kuvet, dan spektrometer. Sedangkan bahan yang digunakan antara lain: aquades, akrilamid, LGB (Lower Gel Buffer), UGB (Upper Gel Buffer), TEMED (Tetra Etil Metil Ethilene Diamine, APS (Amonia persulfat), pepsin, Running Buffer (berisi SDS), larutan pewarna (Croomasil Brilian Blue, metanol, asam asetat glasial, aquabides), larutan pembilas (metanol, asam asetat glasial, aquabides). Pada percobaan Elektroforesis SDS hal yang pertama kali dilakukan yaitu preparasi sampel dan bahan. Sampel yang digunakan yaitu enzim pepsin. Sampel pepsin masing-masing ditimbang dengan timbangan analitik sebanyak 0,005 gr, 0,0075 gr, 0,01 gr, 0,0125 gr, dan 0,015 gr. Kemudian masing-masing sampel dibungkus dengan kertas alumunium foil. Proses selanjutnya yaitu pembuatan separating gel (gel pemisah). Namun sebelum pembuatan separating gel dilakukan preparasi bahan-bahan penyusunnya seperti APS. Untuk APS (Amonium persulfat) ditimbang sebanyak 0,1 gram. APS digunakan sebagai inisiator yang dapat mengaktifkan akrilamid agar bereaksi dengan gel poliakrilamid lain membentuk rantai polimer yang panjang. Separating gel yang akan dibuat berfungsi untuk memisahkan atau menseparasi protein berdasarkan berat molekulnya. Pertama dimasukkan aquades 1700 µL, 30% Akrilamid 200 µL, dan LGB 1300 µL ke dalam beaker glass. Penambahan akrilamid berfungsi untuk menentukan pori-pori gel pada proses pemisahan gel sedang LGB sebagai buffer. Setelah itu dimasukkan 10% APS 40 µL dan TEMED 35 µL secara bersamaan dengan mikropipet supaya terjadi polimerisasi secara sempurna. Setelah itu diaduk supaya homogen. Sebelum separating gel dimasukkan ke dalam cetakan, terlebih dahulu kaca loading dibersihkan dengan cara dibilas menggunakan aquades sampai bersih kemudian di lap searah menggunakan tisu,hal ini bertujuan agar kaca tidak tergores sehingga mempengarui proses analisis yang dilakukan. Setelah itu kaca loading dipasang pada alat elektroforesis, separating gel yang telah dibuat dimasukkan kedalam cetakan dengan menggunakan mikropipet sampai pada batas yang ditentukan 9

Wahyu Erwin Firmansyah THP-FTP-UB-2014 yakni sekitar ¾ bagian dan ¼ bagian sisanya digunakan untuk stacking gel. Setelah itu gel dibiarkan terpolimerisasi dalam suhu ruang selama 15 menit. Kemudian dituangkan sedikit aquades untuk membuat permukaan separating gel datar/gel yang dibentuk tidak bergerigi yang dapat menyebabkan adanya sekat diantara separating gel dengan stacking gel yang dapat mengganggu proses pemisahan molekul. Aquades yang ditambahkan kemudian diserap dengan menggunakan tisu agar tidak mempengaruhi gel yang terbentuk. Selanjutnya dibuat stacking gel (gel pengumpul). Cara pembuatan stacking gel hampir sama dengan pembuatan separating gel, yang membedakan yaitu banyaknya atau jumlah yang ditambahkan. Selain itu pada stacking gel digunakan UGP (Upper gel buffer) sebagai buffer pada gel. Langkah pembuatanya yaitu pertama dimasukkan aquades 1475 µL, 30% Akrilamid 400 µL, dan UGB 625 µL ke dalam beaker glass. Penambahan akrilamid berfungsi untuk menentukan pori-pori gel pada proses pemisahan gel sedang UGB sebagai buffer. Setelah itu dimasukkan 10% APS 20 µL dan TEMED 4 µL secara bersamaan dengan mikropipet supaya terjadi polimerisasi secara sempurna. Setelah itu diaduk supaya homogen. Langkah selanjutnya yaitu memasukkan stacking gel diatas gel pemisah dan disisipkan gigi sisir yang berfungsi untuk mencetak sumuran yang akan digunakan sebagai tempat meneteskan sampel. Gigi sisir dibiarkan sampai gel terpolimerisasi pada suhu ruang selama 15 menit. Setelah terbentuk sumuran selanjutnya gigi sisir diambil dari gel. Gel yang telah terbentuk kemudian dipindahkan ke dalam tank elektroforesis dan siapkan digunakan untuk proses selanjutnya. Sementara itu, sampel pepsin yang masing-masing telah ditimbang sebanyak 0,005 gr, 0,0075 gr, 0,01 gr, 0,0125 gr, dan 0,015 gr yang dibungkus alumunium foil masing-masing dimasukkan ke dalam tabung eppendorf lalu ditambahkan masingmasing sampel buffer sebanyak 0,5 µL yang didalamnya mengandung SDS yang akan memberikan muatan negatif pada sampel yang dianalisis serta β-mercaptoetanol yang dapat mereduksi ikatan disulfida pada protein. Kemudian sampel dipanaskan diatas kompor listrik sehingga sampel dapat terdenaturasi sempurna pada suhu 90˚C selama 5 menit. Selanjutnya sampel diangkat dan didinginkan untuk selanjutnya dilakukan proses analisis. Sampel yang telah tersedia kemudian dimasukkan ke dalam sumuran sebanyak 0,01 µL. Kemudian alat elektrolisis dipasang dan dimasukkan buffer tank ke dalam tank elektrolisis sampai pada batas sumuran. Buffer ini digunakan sebagai penghantar listrik yang akan membantu memisahkan sampel saat alat dinyalakan. Pada proses pewarnaan, gel yang telah dielektroforesis dipindahkan dari tank kedalam wadah plastik. Pewarnaan (staining) pita protein dilakukan dengan jalan

10

Wahyu Erwin Firmansyah THP-FTP-UB-2014 merendam gel hasil elektroforesis (setelah dilepas dari rangkaian plat) dalam larutan Coomasie brilliant blue (CBB) lalu gel yang terdapat dalam wadah plastik dishaker selama 15 menit, penggoyangan perlu dilakukan untuk megoptimalkan reaksi staining yang dilakukan oleh CBB. kemudian dilakukan destaining untuk menghilangkan kelebihan warna dengan jalan merendam gel dalam larutan destaining (aquabides, metanol, asam asetat glasial dan Coomasie brilliant blue) dan dishaker selama 10 menit. Selain itu, perendaman dengan larutan destaining bertujuan untuk menghilangkan CBB yang tersisa dan memperjelas band protein yang terbentuk serta untuk menghilangkan CBB yang tidak berada pada band protein. Setelah itu dilakukan pencucian lagi dengan aquades serta dimasukkan potongan kertas saring untuk menyerap warna yang akan dibilas hingga gel menjadi jernih dengan pita terpisah jelas satu sama lainnya. Pembilasan berfungsi untuk menghilangkan sisa larutan destaining dan menghentikan pewarnaan yang dilakukan oleh larutan destaining. Kemudian dilakukan penghitungan Rf (Retention factor) pada sampel yang telah terpisah yang kemudian digunakan untuk mencari berat molekul dari sampel. Analisis Hasil Elektroforesis Dari hasil percobaan elektroforesis yang dilakukan pada sampel enzim pepsin didapatkan pita-pita dimana dari pita yang terbentuk dihitung panjang atau RF (Retention Factor) yang akhirnya didapatkan BM sampel. Pada percobaan tersebut digunakan marker yaitu protein yang mengandung beberapa komponen enzim. Sementara itu sumuran/well yang terbentuk ada 10 dimana pada sumuran pertama diisi dengan protein marker. Sampel enzim pepsin yang diinjeksikan ada 5 dengan konsentrasi yang berbeda-beda. Pepsin dengan konsentrasi 0,005 µL dimasukkan ke sumuran no.2, pepsin dengan konsentrasi 0,0075 µL dimasukkan ke sumuran no.8, pepsin dengan konsentrasi 0,01 µL dimasukkan ke sumuran no.9, pepsin dengan konsentrasi 0,0125 µL dimasukkan ke sumuran no.10, dan pepsin dengan konsentrasi 0,015 µL dimasukkan ke sumuran no.3. pada sumuran 4,5,6, dan & 7 tidak digunakan karena ada gelembung-gelembung. Setelah dilakukan running, pita yang terbentuk selama percobaan yaitu ada 5. Pada marker I dengan BM 225 KDa, panjang pita yaitu 2,3 cm, log BM 2,352, dan RF 0,479. Pada marker II dengan BM 150 KDa, panjang pita yaitu 2,6 cm, log BM 2,176, dan RF 0,542. Pada marker III dengan BM 100 KDa, panjang pita yaitu 2,9 cm, log BM 2, dan RF 0,604. Pada marker IV dengan BM 75 KDa, panjang pita yaitu 3,5 cm, log BM 1,875, dan RF 0,729. Pada marker V dengan BM 50 KDa, panjang pita yaitu 4,1 cm, log BM 1,698, dan RF 0,854. Pada marker VI dan VII tidak terbentuk pita sehingga tidak dapat diketahui nilai RF. Dari hasil percobaan didapatkan bahwa semakin tinggi konsentrasi

11

Wahyu Erwin Firmansyah THP-FTP-UB-2014 sampel maka pita yang terbentuk akan semakin tebal. RF yang didapatkan merupakan retention factor yaitu faktor retensi atau hambatan yang berarti pemisahan protein pada gel. Prinsipnya yaitu penghambatan terhadap laju migrasi tersebut sehingga pemisahan

dari

karena

protein‐protein perbedaan

berat molekul mengakibatkan terbentuknya pita‐pita pada jarak migrasi yang berbeda satu sama lain dan jarak tersebut di konversi menjadi nilai RF. Dari marker I-V menunjukkan bahwa semakin besar nilai RF maka akan berbanding terbalik dengan berat molekul yang semakin kecil. Dari hasil percobaan didapatkan panjang pita sampel 3,2 cm dengan panjang separating gel 4,8 cm. Sehingga...