Experiment II PDF

Preview

Summary

Practicum Biochemie
Experiment II:
Bepalen zure fosfatase activiteit volgens Kind en King eindpuntmethode

...

Description

Practicum Biochemie

Experiment II: Bepalen zure fosfatase activiteit volgens Kind en King eindpuntmethode

Pauline Bleys Groep 5-8 A Nr. 34 20/11/2018

Inleiding: Het doel van dit practicum is het bepalen van de enzymactiviteit van een onbekende zure fosfatase en de concentratie van een onbekende fenoloplossing. Dit wordt bepaald door middel van de Kind en King eindpuntmethode. Hierbij wordt gebruik gemaakt van een spectrofotometer waarin de absorptie van het gevormde product wordt gemeten op een golflengte van 500 nm. Via een opgestelde ijklijn worden de onbekende waarden bepaald.

Materiaal en methode: Als voorbereiding werden er twee verdunningsreeksen gemaakt, één voor de fosfatase stockoplossing en één voor de fenol stockoplossing. Ook een tijdschema werd opgesteld.

% concentratie vs stock

mL fosfatase stock

mL gedestilleerd water

20

1

4

40

2

3

60

3

2

80

4

1

100

5

0

Proefbuis

tijd toevoeging enzym (min)

tijd toevoeging NaOH (min)

20%

0

30

40%

1

31

60%

2

32

80%

3

33

100%

4

34

Onbekende 1

5

35

Onbekende 2

6

36

% concentratie vs stock

mL fenol stock

mL gedestilleerd water

20

1

4

40

2

3

60

3

2

80

4

1

100

5

0

Resultaten en berekeningen:

1. Bepalen zure fosfatase activiteit

% fosfatase verdunning

Absorptie

Absorptie blanco

Absorptie netto

20

0,322

0,057

0,265

40

0,615

0,058

0,557

60

0,929

0,059

0,870

80

1,329

0,059

1,270

100

1,769

0,058

1,711

Absorptie

Absorptie blanco

Absorptie netto

Onbekende 1

0,709

0,060

0,649

Onbekende 2

0,779

0,063

0,716

Gemiddelde

0,744

0,062

0,682

Er wordt een calibratiecurve opgesteld van de netto absorptiewaarden. Via deze curve wordt de onbekende concentratie bepaald.

vergelijking y = 0,018x - 0,1469 x = % fosfatase verdunning y = netto absorptie yonbekend = 0,682

0,682 = 0,018x - 0,1469 → x = (0,682 + 0,1469) / 0,018 → x = 46,1% fosfatase vs stock

2. Fenolbepaling % fenol verdunning

Absorptie

Absorptie netto

20

0,211

0,141

40

0,352

0,282

60

0,501

0,431

80

0,649

0,579

100

0,799

0,729

Absorptie

Netto absorptie

Onbekende 1 0,371

0,301

Onbekende 2 0,369

0,299

Gemiddelde onbekende

0,370

0,300

Blanco 1

0,073

/

Blanco 2

0,067

/

Gemiddelde blanco

0,070

/

vergelijking y = 0,0074x - 0,0095 y = netto absorptie x = %fenol verdunning y onbekend = 0,300 0,300 = 0,0074x - 0,0095 → x = (0,300 + 0,0095) / 0,0074 → x = 41,8 % fenol vs stock De enzymconcentratie van de onbekende fenol oplossing bedraagt 41,8% vs stock. De stockoplossing had een concentratie van 35 mg/L. MM bedraagt 94,11 g/mol → 41,8 % * 35 mg/L = 14,6 mg/L → 14,6 mg/L / 94,11 g/ mol = 0,156 mM = 156 μM

3. Eiwitbepaling volgens Bradford 5mg/2L = 2,5 mg/L = 2,5 mg/mL

4. Specifieke activiteit Netto absorptie =0,682 Ijklijn fenol y = 0,0074x - 0,0095 x = (0,682 + 0,0095) / 0,0074 x =93,4 % fenol vrijgesteld vs stock 93,4% x 35 mg/L =32,7 mg/L = 32,7μg/mL

Vtotaal = 6mL 32,7μg/mL * 6mL = 196 μg vrijgesteld in 30 minuten (196 μg) /( 94,11 g/ mol) = 2,09 μmol fenol vrijgesteld in 30 min

Specifieke activiteit: Concentratie eiwit = 2,5 μg/mL 2,09 μmol / (250 mg/mL * 30 min * 6mL) = 4,64 μmol fenol per mg eiwit per minuut

Conclusie: De enzymconcentratie van de onbekende zure fosfatase oplossing werd berekend op 46,1% versus stock. De fenolconcentratie in de onbekende fenoloplossing was gelijk aan 41,8% versus stock. Dit komt overeen met mg/L of 0,156mM (156μM). De enzymactiviteit is gelijk aan 196 μg vrijgesteld in 30 min of 2,09 μmol fenol vrijgesteld in 30 min. De specifieke activiteit is gelijk aan 4,64 μmol fenol per mg eiwit per minuut....