Fascicule+TP+printemps+2019 PDF

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Fascicule tp...

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TP ADN EXTRACTION D’ADN A PARTIR DE LA BANANE

MATERIEL - tubes de 50 mL, 15 mL et 5 mL - cuves spectromètre (UV) Tris- mortier + pilon - SDS 10% - spatule/cuillère - NaCl 5 mol.L-1 - 1 entonnoir - Ethanol absolu - papier filtre - Solution de - pipettes Pasteur - TAE 10X (400 - petite poire pH=8)

PRODUITS Tampon d’extraction Tris-EDTA (TE 10X): 100 mmol.L-1 HCl, 10 mmol.L-1 EDTA, pH=8 (sodium dodécyl sulfate) (95°) placé au congélateur rinçage : Ethanol à 70% mmol.L-1, Tris-Acétate, 10 mmol.L-1 EDTA,

1. INTRODUCTION : Les acides nucléiques sont des polymères de nucléotides. Ils jouent un rôle important dans le support et le transfert de l’information génétique. Ce sont des macromolécules pouvant atteindre une taille très élevée, ex : l’ADN de la bactérie Escherichia coli a un PM = 2x109 Daltons et dépasserait le millimètre s’il n’était pas compacté, alors que la cellule qui le contient n’a que 1 à 2 µm de diamètre. Excepté dans les globules rouges des mammifères, qui sont dépourvus de noyau, toutes les cellules d’un être vivant contiennent de l’ADN.

Dans les manipulations qui suivent nous proposons : 1/ d’extraire l’ADN à partir d’un tissu biologique, 2/ d’étudier une des propriétés physicochimiques : l’absorption dans l’ultra-violet, 3/ d’utiliser ces propriétés physicochimiques pour quantifier l’ADN contenu dans l’échantillon biologique, 1

4/ de manipuler des données scientifiques (calculs de dilutions et de concentrations, travail sur les unités, loi de Beer Lambert...) Tout au long de ce TP vous allez développer des compétences scientifiques et techniques qu’il est nécessaire d’identifier pour les valoriser tout au long de votre cursus universitaire et dans votre vie professionnelle. 2. MODE OPERATOIRE 2.1 Préparation de l’ADN a) Homogénéisation du tissu - A partir de la solution stock (TE 10X) concentrée fournie, préparer 50 mL de tampon TE 1X dans un tube Falcon de 50 mL. Réservez. - Peser le morceau de banane fourni et noter la masse. - Ecraser la banane dans le mortier en porcelaine avec une spatule/cuillère jusqu’à obtenir une purée homogène. - Ajouter 15 ml du tampon TE 1X et homogénéiser. - Transvaser l’homogénat de banane à un tube de 50 mL et centrifuger 5 minutes à 2000 tours par minute. b) Lyse des cellules - Filtrer le surnageant obtenu sur un papier filtre à l’aide d’un entonnoir dans un tube Falcon de 50 mL. Recueillir environ 10 - 15 mL (V1). Compléter si besoin avec de TE 1X. - Ajouter du SDS (10%) pour obtenir une concentration finale de 1% et agiter au vortex 1 minute. - Ajouter un volume de NaCl 5M égal à 1/2 V1. - Agiter fortement au vortex pendant 2 minutes. c) récupération de l’ADN - Centrifuger le tube pendant 10 minutes à 3000 tours par minute. - Récupérer le surnageant dans un tube de 50 mL propre avec une pipette Pasteur et une petite poire, noter le volume (V2). - Ajouter lentement, le long des parois du tube, 2 volumes V2 d’éthanol froid (congélateur). - Après 1 ou 2 minutes une « méduse » d’ADN se forme à l’interface tampon/éthanol. Pendant que la « méduse » d’ADN se forme préparer : 1) Un tube à essai contenant 3 à 4 mL d’éthanol 70%. 2) Préparer 10 mL de tampon TAE 1X (ATTENTION !!!) dans l’éprouvette graduée à partir du stock TAE 10X, et transvaser dans un tube Falcon de 15 mL. 3) Mettre 3 mL du TAE 1X dans un autre tube Falcon de 15 mL. - Récupérer l’ADN en l’enroulant autour d’une pipette Pasteur propre et le placer dans le tube à essai contenant l’éthanol à 70%. - Rincer l’ADN dans de l’éthanol 70% pendant 30 sec. - Placer la pelote d’ADN dans le tube Falcon de 15 mL contenant 3 ml de TAE 1X et vortexer pendant 1 minute.

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2.2 Dosage Diluer 600 µL de solution d’ADN que vous venez de préparer dans 2,4 mL de TE 1X (solution utilisée pour écraser la banane) dans le tube à essai restant. Vortexer. Mesurer l’absorbance de cette solution dans une cuve adaptée à 260 nm et à 280 nm (penser faire le 0 avec de l’eau distillé, et à faire le blanc de l’essai avec le tampon TE 1X). Utiliser tout le temps la même cuve pour tous les dosages.

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Pour des solutions d’ADN pures, le rapport d’absorbance 260/280 est compris entre 1,8 et 2. Si ce rapport est inférieur à 1,8 l’extrait d’ADN est contaminé par des protéines. Si en revanche le rapport est supérieur à 2, l’extrait d’ADN est contaminé par de l’ARN. A 260 nm, le coefficient d’extinction spécifique (E) de l’ADN double brin est d’environ 0,02 (µg/ml) cm-1 NOMS/PRENOMS : GROUPE : DATE : 1

COMPTE-RENDU TP BANANE, REPONDRE AUX QUESTIONS SUIVANTES :

Les questions avec un astérisque

* (1, 2, 3.1, 3.2) sont à préparer avant la séance de TP

*1. But(s) du TP : Ce TP consiste à extraire et mettre en évidence l’ADN des cellules d’un morceau de banane. A l’aide des propriétés physicochimiques de l’ADN telle que l’absorption dans le domaine des UV, nous quantifierons par la suite l’ADN contenu dans l’échantillon biologique.

*2. Principe(s) des manipulations (énumérer): -Homogénéisation du tissu : Cette étape permet de préparer l’extraction de l’ADN de l’échantillon de banane en homogénéisant le tissu biologique avec une solution tampon TE 1X -Lyse des cellules : Destruction des membranes cellulaires à l’aide du SDS puis du NaCl -Récupération de l’ADN : Grâce à cette étape on isole la « méduse » d’ADN à l’aide d’éthanol, une solution tampon ainsi qu’une centrifugation. -Dosage : On dilue la solution d’ADN dans du TE 1X puis on mesure l’absorbance du mélange dans l’UV (260 nm- 280 nm) A l’aide de la loi de Beer-Lambert, on peut finalement trouver la concentration et la quantité d’ADN présente dans l’échantillon de base.

3. Résultats :

*3.1 Quel est le rôle du SDS et du NaCl dans cette expérience ? 3

 Le SDS est un détergent, il va provoquer la destruction des membranes cellulaires et nucléaires. Ainsi, l’ADN sera plus facilement extractible. Le NaCl se fixe autour des molécules d’ADN chargées. En présence des ions Na+, l’ADN se détache et précipite ce qui facilite également son extraction.

*3.2 Notre ADN est-il fragmenté après les procédures réalisées dans ce TP ? Pourquoi ? Nommez 2 procédures qui fragmentent l’ADN.  Notre ADN est intact après les procédures réalisées lors de ce TP puisqu’il s’agit simplement d’une séparation entre l’ADN et les protéines et non pas les morceaux d’ADN entre eux. Le but est de récupérer l’ADN seul sans fragmentation. Pour fragmenter l’ADN, on peut utiliser des enzymes de restriction (ex : Eco RI, ainsi que la DNase (Désoxyribonucléase)

Les questions avec # (3.5, 3.9, 3.10 et 3.11) seront notées pendant la séance de TP 3.3 Quelle était la masse de votre morceau de banane ? 3.4 Quel était le volume du filtrat (V1) ? #3.5 Détails des calculs du volume de SDS ajouté :

3.6 Quel était le volume de NaCl ajouté ? Quelle sera la concentration de NaCl finale dans le tube ?

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3.7 Volume du surnageant d’ADN (V2) : 3.8 Quelle dilution a-t-on fait pour mesurer les absorbances 260 et 280 nm ? - Notez les absorbances: A260=

A280=

- Calculer le rapport 260/280

#3.9 Donner vos conclusions sur le degré de pureté de votre extrait d’ADN

#3.10 Calculer la concentration (en µg/ml) de la solution d’ADN que vous avez purifiée, en utilisant la loi de Beer-Lambert.

#3.11 Quelle était la quantité d’ADN présente dans 1 g de banane ? Détailler le calcul.

4. Conclusion (résumé TP, résultats principaux, schéma, critique constructive, autres techniques…)

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Fig.1 Spectre d’absorption de l’ADN (SAB=albumine sérique bovine) 5. Compétences développées : Compétences scientifiques : Manipuler avec précision et en respectant les règles de sécurité du laboratoire. Manipuler des données chiffrées (réaliser des calculs de dilution, de concentration, des changements d’unités) Réaliser une extraction biochimique (ADN, protéines) Réaliser une mesure d’absorbance, utiliser un spectrophotomètre. Rédiger un compte rendu scientifique Suivre un protocole expérimental

Compétences transversales : Coopérer pour arriver à des objectifs Evaluer la pertinence de l'information trouvée, l'ordonner, la hiérarchiser, la synthétiser Gérer son temps, planifier, anticiper Identifier les sources d'erreurs Identifier, définir, hiérarchiser les activités à accomplir Savoir travailler en équipe

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