Genregulatie PDF

Preview

Summary

genregulatie...

Description

Genregulatie bij eukaryoten In de cellen van een eukarotisch organisme zijn alle chromosomen aanwezig  cel differentiatie is dus niet het gevolg van verschillen in aanwezige genetische info maar wel in de manier waarop die genetische informatie tot uitdrukking komt. Bovendien moeten eukaryotische cellen in staat zijn om op veranderingen in de omgeving te reageren. Genregulatie nodig voor: cel differentiatie respons op wijzigingen in situatie Genregulatie kan zich op 3 verschillende manieren voordoen: niveau transcriptie niveau van mRNA-processing niveau van translatie

Stabiliteit van de gedifferentieerd staat Cellen niet spontaan veranderen van celtype ze zijn committed. Dit houdt verband met de -

Structuur gevormd door DNA

-

Structuur van geassocieerde eiwitten

chromatinestructuur

CHROMATINESTRUCTUUR Chromosomen zijn opgebouwd uit chromatine. De basiseenheid van chromatine is het nucleosoom waarin ongeveer 200 bp geassocieerd zijn met een histonenoctameer. Histonen zijn specifieke eiwitten die samen met het DNA in de celkern het chromatine vormen. Histonen dienen als bouwsteen voor de nucleosomen, die het DNA dragen. 8 histonen vormen een eiwitbolletje dat een kern vormt waar omheen het lange DNA molecule is gewonden. Chromosomen zijn opgebouwd uit chromatine 2x H2A, H2B, H3, H4 2 omwentelingen DNA rond octameer : 146bp Overige baseparen : linker tussen 2 nucleosomen Linker gevoelig voor micrococcal nuclease Linker stuk tss nucleosomen, verbind ene met de andere Histon 1 zet structuur vast Ongeveer 146 bp van het DNA maken twee volledige omwentelingen rond deze histonen terwijl de overige bp als linker tussen twee nucleosomen fungeren. Het linker dna is gevoelig aan micrococcusnuclease waardoor individuele nucleosomen kunnen worden afgesplitst.

Chromatine  basiseenheid: nucleosoom Nucleosomen vormen samen een solenoide  histon 1 belangrijke rol: - vastleggen omwenteling octameer - 1 histon 1 molecule verzegelt de dubbele wending van een nucleosoom  in het solenoide gaan alle histon 1 moleculen met elkaar associëren  nucleosomen gecomprimeerd in 30 nm fiber Dit is de chromatinestructuur van cellen die geen celdeling ondergaan!!!! Histonen zijn rijk aan basische aminozuurresten hetgeen hun affiniteit voor DNA (=zuur) verklaart. Solenoid vormt scaffold rond nucleaire matrix. Door lusvorming van solenoid  300 nm, 700nm en metafase chomosoom, fiberlussen worden gekoppeld op de nucleaire matrix

Hoe denser het DNA is opgevouwen hoe moelijker een eiwit kan binden (mRNA)  moeilijker transcripie

Gewijzigde chromatinestructuur in (potentieel) actieve genen DNA dat actief wordt overgeschreven behoudt gewoonlijk de nucleosoomstructuur. Open = eu / gesloten = hetero Euchromatine bevat (potentieel) actieve genen en is minder compact.  chromatine van actieve genen Heterochromatine bevat genen die niet tot expressie komen.  chromatine van genen die niet tot expressie komen (komt niet tot expressie, dens opgevouwd) - constitutief heterochromatine DNA dat NOOIT tot expressie komt in bepaald celtype - facultatief heterochromatine (in dens opgevouwen) DNA dat kan overgaan naar euchromatine , in bepaalde fase van ontwikkeling, onder invloed van omgevingsfactor, … Aangezien een bepaald gen in één celtype misschien NOOIT actief kan zijn en in een ander (potentieel) wel actief,  chromatinestatus van een gen kan verschillen per celtype Chromatinestatus = celtype-afhankelijk = epigenetisch overerfbaar van een moedercel naar zijn dochtercel  epigenetica epi (bovenop) genen (wanneer een bepaald gen in een bepaald celtype de heterochromatinestructuur aanneemt, dan zal het ook in de volgende generaties van dat celtype zo blijven. De structuur is dus overerf baar.  epigenetica Euchromatine en heterochromatine verschillen o.a in: - DNase I gevoeligheid - DNA-methylatie - histonmodificatie DNA-se gevoeligheid Actieve genen zijn gevoeliger voor DNAse. Dit komt omdat hier structuur hoger dan de nucleosoomstructuur ontbreekt waardoor het DNA veer toegankelijker is voor DNAse. Deze gevoeligheid blijft ook bestaan wanneer het gen achteraf naar de inactieve staat overgaat. DNA I gevoeligheid duid de mogelijkheid aan van een gen om in een bepaald weefseltype te worden overgeschreven. Genen die in een bepaald celtype actief (kunnen) zijn hebben gewoonlijk wel de nucleosoomstructuur over heel hun lengte maar geen hogere structuur Commitment heeft dus invloed op de chromatinestructuur Deze gevoeligheid is niet rechtstreeks te wijten aan transcriptie want ze blijft ervoor en erna bestaan DNA – methylatie Sommige basen kunnen in gemethyleerde vorm voorkomen  meest voorkomende vorm: 5methylcytosine. 90 % van het gemethyleerde cytosine wordt gevolgd door een G en maakt dus deel uit van een CG dinucleotide of zogenaamd CG eilandje. Men heeft vastgesteld dat dergelijke methylatie nagenoeg afwezig is in weefsel waarin een gen actief is en aanwezig in weefsel waarin het gen niet actief is.

 methylatie verhindert de binding van bepaalde transactiverende factoren. DNAse gevoelige zones, ondergemethyleerde zones en histon 1-vrije zones blijken elkaar te overlappen Methylatie : 5-methylcytosine, 2-7% van alle cytosine’s is gemethyleerd, in 90% van de gevallen in CpG eiland (een C gevolgd door een G) WEL methylatie  GEEN transcriptie ; GEEN methylatie  WEL trancriptie mogelijk WANT mehtylatie verhindert binding van transcriptiefactoren Bepaalde expressie-inhiberende eiwitten (MeCP1, MeCP2 en andere gerelateerde eiwitten) binden preferentieel op gemethyleerd DNA. Recrutering van een co-factor,Sin3, door MeCP2 resulteert bovendien in deacetylering van histonen, een eigenschap die eveneens gerelateerd is aan inactivering van expressie. Methylatie zorgt voor mogelijke binding van expressieinhiberende eiwitten Vb MeCP2  deacetylering van histonen overlap ondermethylatie met DNaseI gevoeligheid en gebrek aan histon H1 Methylatie zorgt voor compacte opvouwing en mogelijke binding van expressie inhiberende eiwitten Weefselspecifieke expressie als gevolg van verschillen in methylatiegraad verklaart zowel de stabiliteit als de mogelijke verandering van de committed state. - enzym DNA-methyltransferase enkel hemigemethyleerde plaatsen in dubbelstrengig DNA zal methyleren waardoor een bepaald methylatiepatroon na replicatie in stand kan worden gehouden. - tijdens proces commitment zouden bepaalde methylatieplaatsen verloren gaan door een demethylatie of een inhibitie van het methylerend enzym op een bepaalde plaats, door dit£ laatste zou een dochtercel ontstaan zonder methylatie (committed state), en 1 met methylatie (stem cell)

Figuur van hoe cellen committed worden, of behouden blijven als stamcel

Naast in stand houden van weefsel specifieke expressiepatronen heeft DNA methylatie bij eukaryoten nog 3 functies: 1. In vele genomen zijn transposons en andere repetitieve sequenties hypergemethyleerd, wss om transposities en recombinantie tegen te gaan en aldus te verhinderen dat het DNA ongewenste schade zou oplopen. 2. Methylatie ligt ook aan de basis van genomische inprenting, een proces waarbij ervoor gezorgd wordt dat slechts 1 van de parentale genen tot uitdrukking komt 3. Methylatie ligt ook aan basis X-chromosoominactivatie  bij meisjes slechts 1 X chromosoom tot expressie komt in elke cel Speelt een rol in: •

weefselspecifieke expressie  gedifferentieerde status

•

stil houden van transposons en andere repetitieve sequenties

•

genomische inprenting (imprinting) stil houden van één van de parentale genen Onomkeerbaar

•

X-chromosoominactivatie

Zorgen dat transposons niet verder hercombineren of voor DNA (expressie) schade zorgen Genomic imprinting is onomkeerbaar ook na kruising (levert dan misschien 2 gesilencete genen op en kan dan lethaal zijn, verhindert parthenogenese) X-chromosoom inactivatie  slechts één van beide X-chromosomen is actief Barr lichaampje : heterochromatine met minder Dnase gevoelige sites, meer methylatie en minder acetylering

Modificatie van histonen Veel verschillende soorten modificaties: acetylatie, methylatie, fosfrylatie, … Combinaties van specifieke histonmodificaties bepalen funcites van lokale chromatinegebieden  histoncode Volgende modificaties worden gercorreleerd met genactivatie: Acetylatie In dit geval wordt één van de waterstofatomen, die deel uitkamen van de vrije aminogroep van lysines in histonen, geacetyleerd (CH3CO). Deze modificatie, die de netto pos lading van het histon reduceert, wordt vooral aangetroffen bij histon H3 en H4 en hypergeacetyleerde vormen van deze histonen worden vooral in actieve, DNAse I gevoelige gebieden aangetroffen. Histon-deacetylasen zijn betrokken in transcriptionele repressie -> corepressors histonacetylatie is niet de enige manier waarom euk cellen genen bereikbaar maken voor de transcriptiemachinerie  ook chromatine-hermodelleercomplexen  best bekend: SWI/SNF familie SWI/SNF is samengesteld uit een 10 tal subunits en wordt via TF’n aan promotor gekoppeld Gevolgen  Conformatieverandering in nuclesomen  Histonacetylatie  Verschuiving in nucleosoomplaatsen waardoor een stuk DNA ‘bloot’ komt te liggen  Dnase I gevoelig wordt Fosforylatie p 187 Ubiquitinatie Het plaatsen van een ubiquitin groep of groepen op histonen kan leiden tot een versterkte mogleijkheid tot genactivatie. Ubiquitinatie van H2A is vooral betrokken bij DNA herstel na schade door bijvoorbeeld UV stralen. Vormt een conjugaat met H2A door koppeling van de C-terminale carboxylgroep met de aminogroep van Lys →vermindering van de positieve lading van het histon en dus van de binding ervan met DNA Losmaken chromatine, Van belang bij DNA repair

Volgende modificaties worden gercorreleerd met genINactivatie: Methylatie p 187 Ubiquitinatie p 187

DNAse hypergevoelige plaatsen • •

in potentieel actieve genen veelal in gebieden die te maken hebben met genregulatie (afstand tot transc ini plaats = variabel)

•

vrij van nucleosoomstructuur

•

vertonen vaak Z-DNA structuur

•

sommige regulerende factoren creëren zelf een nucleosoomvrije zone (HSF versus glucocorticoid receptor)

P188 –> X chromosoom inactivatie

Eukaryotishe promotorgebieden Elementen van een eukaryotische RNA-polymerase II promotor Prokaryoten  1 RNA polymease Eukaryoten  3 RNA polymerases RNApol I  rRNA 18 S en 28 S RNApol II  mRNA en kleine RNAs RNA pl III  tRNA 5S rRNA en enkele kleine Elk pol zijn eigen type promotor,  hier beperking tot RNAPOl II Eukaryoten hebben 3 polymerasen. RNA polymerase I staat in voor de aanmaak van 18S en 28S ribosomaal RNA. RNA polymerase ll staat in voor de aanmaak van mRNA en enkele kleine RNA’s. RNA polymerase lll staat in voor de aanmaak van tRNA, 5S rRNA en enkele kleine RNA. Promotor alle sequentie-elementen die een rol spelen bij het opstarten van transcriptie •

niet zo mooi afgebakend als bij prokaryoten

•

variabele lengte

•

meestal basale promotor met stroomopwaarts bijkomende promotorelementen

Alle andere eiwitten dan RNA polymerase ll die noodzakelijk zijn voor transcriptie  transcriptiefactoren Constitutieve elementen: Basale promotor = core promotor  twee elementen: 1. Een -25 TATA box 2. Initiatorseq (Inr) rond positie +1 Sommige promotors slechts 1 van beide en sommige geen van beide  dit zijn null genen. Genen die geen TATA box hebben  ander element: DPE (downstream promotor element) rond positie +28 en +32. Proximale promotorelementen 1. CAAT box 2. GC box respectievelijk door transcriptiefactoren NF1 en SP1 herkend, 100-150 nucleotiden van TATA box 3. Octameerseq door factoren Oct1 en Oct2 herkend

• • •

Responsieve elementen  Transcriptie factor-bindende elementen voorbeelden : HSE, SRE, GRE, …. Wanneer verplaatst  ander promotor wordt ook gevoelig voor stimulus (zie biotechnologie III) Elke genpromotor een specifieke (combinatie van) RE • vaak RE gemeenschappelijk voor verschillende genen • Verwante promotoren < evolutionaire geschiedenis • Weefselspecifieke genexpressie mogelijk

Illustratie in welke mate bepaalde deleties (awatte balken de transcriptie van het gen doen dalen Normaal = 100% = 1 voorbeeld , effect is promotorafhankelijk

Werkingsmechanisme van promotorelementen Bij eukaryoten  promotor: alle seq die nodig zijn om de initiatie van transcriptie mogelijk te maken. Dit behelst dus zowel de basale promotor of core promotor (DPE) als de diverse stroomopwaarts gelegen promotorelementen die van het promotorgebied deel uitmaken. RNA polymerase ll kan de promotor seq niet direct herkennen  algemene transcriptie factorTFIID nodig , een complex bestaande uit TBP en minstens 12 andere hiermee geassocieerde factoren (TAF’s). Wanneer TFIID gebonden is (=pre-initiatiecomplex) kunnen nu ook nog andere TF’s binden in

de volgorde: TFIIA, TFIIB, TFIIF/RNA-pol II, TFIIE en TFIIH. TFIIH heeft zowel helicase functie als een kinase functie: door fosforylatie van RNA-polymerase ll kan de transcriptie effectief beginnen.

Enchancers & silencers = seq in promotor Regulerende rol hebben in transcriptie. Kunnen op grote afstand van de transcriptie initiatie plaats liggen. Ze worden gebonden door transcriptiefactoren en worden algemeen transcriptiefactor responselementen genoemd. De transcriptiefactoren die binden op een enhancer en de mate van transcriptie verhogen  activators De transcriptiefactoren die binden op een silencer en de mate van transcriptie verlagen  repressors Activators en repressors worden op hun beurt gebonden door andere eiwitten namelijk co-activators en co-repressors  cofactors

Enhancers

zijn zelf niet in staat om initiatie van transcriptie mogelijk te maken maar kunnen de werking van een promotor aanzienlijk versterken. Variatie in positie en oriëntatie v/e enhancer tov de promotor heeft aangetoond dat: • Een enhancer actief is zelf wanneer 1000 nucleotiden ver van promotor • Oriëntatie geen rol speelt • Enhancer actief ongeacht stroom opwaarts of afwaarts van gen Enhancer= sequentie in DNA die reageert op activator: •

Kunnen verplaatsen

•

Kunnen omdraaien

•

Kan ver van doelwit/ promotor liggen

Weefselspecificiteit Hoewel enhancers in alle weefsels aanwezig zijn, zijn ze niet in alle weefsels functioneel !!! Reden: ter hoogte van enhancers binden weefselspecifieke transcriptiefactoren, soms is zelfs de promotor slechts weefselspecifiek actief. Enhancer = ook TF-RE genoemd Kan enkel actief zijn als weefselspecifieke TF ook effectief tot expressie komt

Voorbeeld: T antigeen van SV40 voorzien van insuline enhancer en introductie in bevruchte muize-eicel: enkel optimale expressie van T-antigeen in beta cellen van pancreas

Weefselspecifieke expressie bepaald door - enhancers (TF-RE) - Omringende chromatinestructuur

Werkingsmechanisme • • •

•

vaak opgebouwd uit zelfde of gelijkaardige sequenties als promotors binden vaak dezelfde of gelijkaardige transcriptiefactoren; de fundamentele eenheid van een enhancer = enhanson beïnvloeden transcriptie door disruptie van de nucleosoomstructuur en/of directe interactie met eiwitten van het transcriptiecomplex enhancers zijn dus nucleosoomvrij en daarom DNase hypergevoelig

TF-RE binnen promotor, Daarbuiten, idem, maar dan enhancer genoemd Enhanson = enhancer gebonden door bindend eiwit

Eiwit dat bindt op een enhancer = activator, maar eigenlijk vooral transcriptiefactor Looping  en dus locatie en oriëntatie onafhankelijk

Co-activator = mediator Distale promotor elementen reguleren samen met proximale promotorelementen en basale promotor de transcriptie Distaal kan in beide richtingen werken

Silencers Genexpressie inhiberen

LCR: locus control region

Eigenschappen •

wanneer een gen in een andere chromosomale context geplaatst wordt beïnvloedt dit de expressie meestal negatief, zelfs al zijn alle enhancers intact

•

dit suggereert dat bepaalde sequenties, nodig voor hoge expressie, ontbreken op het (verplaatste) gen

•

 Ontdekking van LCR’s: controleren de expressie van gen clusters Idee zou ook kunnen zijn dat silencers van andere genen er een effect op kunnen hebben Maar kans is grootst dat verplaatste gen in intergenisch gebied terechtkomt door grootte inter en intragenische gebieden En dus was hypothese van een ‘sequentie die gen onafh positie stimulleert ‘aannemelijker

B-globine gen cluster Psi  pseudo Andere gekleurde = functionele b-globine genen Weefselspecifieke (enkel in erythrocyten ) Locus controle door gebied 10-20 kb upstream LCR werkt in dit geval enkel in erythrocyten, maar is daarom niet altijd weefselspecifiek Deletie LCR  Hispanic Thalassemia = dodelijke ziekte met gebrek aan b-globine expressie

Werkingsmechanisme •

beïnvloeden chromatinestructuur van nabij gelegen genen

•

DNase hypergevoelig en waarschijnlijk in supercoil vorm

•

torsie veroorzaakt gewijzigde chromatinestructuur in het gen en verwijdering van H1

•

zouden een rol spelen bij het maken van lussen op nucleaire matrix

Overzicht PRO vs EUK

Co-repressor in een eukaryoot wil niet idem zeggen als in een prokaryoot Vul deze aan op de tekening ! LCR waar zou je die tekenen ? Teken bij figuur ! (niet in prokaryoot, in 1 van de 2 lussen van eukaryoot8 Ambigue rol : co-repressor vs co-activator (kan andere functie hebben voor ander gen)  co-factor is beter als naam Weefselspecificiteit : - cel-specifieke chromatine structuur (open or closed dep cell type; enhancer ready or not) - Aanw expressie TF - LCR...