Hemostase:Coagulação PDF

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Principais patologias de coagulação...

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Importância da Pré-Analítica no Laboratório de Hemostase Está provado que hoje em dia, a maior parte dos erros que há no laboratório, são na fase pré-analítica. A hemostase, dentro da patologia clínica é a área com menos conhecimento, mais pequena, aquela a que se liga menos, e que em termos de urgência poderá ser aquela que nos trará algumas surpresas e algumas complicações, na maneira de interpretar o resultado, e verificar se ele está com algum erro, ou se é mesmo a realidade do doente. A função da hemostase é tentar manter o sangue líquido dentro dos vasos sanguíneos, e fazer a sua reparação quando existem lesões. O que fazemos in vitro quando queremos estudar a hemostase, no fundo é mimetizar parcelas de coagulação. A coagulação é dinâmica, não é primeiro isto, depois aquilo, ela ocorre simultaneamente, mas para podermos estudar no laboratório, temos que dividir em parcelas, e mimetizar o que se passa fisiologicamente. Isto tem muitas interferências inerentes ao doente, inerentes a nós próprios, aos nossos conhecimentos, ao material que temos, etc. Existem praticamente 4 fases, todas se dão ao mesmo tempo, existe a fase vascular, quando se dá a lesão, e aqui, a participação das plaquetas é muito grande, e é a inicialização, a fase da coagulação, são as proteínas e os seus complexos que vão regular esta coagulação, até se formar um trombo fibrinoplaquetar, irá fazer a cicatrização, e depois é preciso removê-lo. São mecanismos extremamente complexos e dependentes uns dos outros, com a desvantagem de os nossos valores de referência compreenderem intervalos muito alargados. É completamente impossível reproduzir condições fisiológicas in vitro num laboratório de coagulação, visto que assim que tiramos sangue do doente, a coagulação começa logo a dar-se. O que nós queremos agora é trabalhar em qualidade, saber que o resultado é um resultado fiável, é um resultado que o doente realmente tem, porque isto tem implicações no diagnóstico e terapêutica do doente. Temos que pedir coisas que beneficiem o doente, e não vale a pena estar a pedir muitos exames, que não levam a nada, e que poderão baralhar mais o clínico, e a póspós analítica, é com tantos exames, saber qual o verdadeiro significado. A fase analítica é mais pequena porque… Nas últimas décadas, o que temos visto é um avanço da genética, passámos também a conhecer melhor as proteínas da coagulação, onde atuam, e com isso também foi possível arranjar sistemas e métodos, e automatizar, e houve então um avanço analítico muito grande. Passámos de métodos manuais, para totalmente

automatizados, e portanto minimizando o erro cometido pelo operador. Antes, a formação do coágulo era vista pelo operador, e contava-se o tempo, isto levava a que diferentes operadores tivessem resultados diferentes, a automatização acabou com isso. A fase analítica acabou por ter vantagem, e minimizar erros que se cometiam, o que também ajudou foi o avanço da genética, passamos a poder quantificar proteínas da coagulação, que antes não era feito. Existe um grande faixa de proteínas da coagulação, que nós não conseguimos avaliar a sua atividade, e é através da genética e dos seus determinantes imunológicos, que vamos saber se eles estão aptos ou não aptos, com algum erro. No caso da pré-analítica, o problema tem sido as fusões, laboratórios centrais, e laboratórios mais pequenos, 50/60% dos testes não são feitos onde o sangue é colhido, então esta fase começou a ter muitas variáveis, há muita gente envolvida, desde a pessoa que colhe, à pessoa que transporta, etc… e passou então a ser uma fase muito problemática. Às vezes temos valores “border-line”, pedimos que a pessoa venha colher novamente, mas ao laboratório central, e dão valores normais. Estes elementos todos que fazem parte da pré-analítica, têm interferência de muita gente, então à que criar guidelines, para que isto seja estreito, e os erros possam ocorrer com menos frequência. Foram estudados os erros das várias fases que compõem hoje a garantia da qualidade, verificou-se que a fase pré-analítica é onde ocorre o maior nº de erros. Isto foi um estudo realizados, onde verificaram que os erros poderiam dar diagnósticos incorretos, ou terapêuticas inconsequentes ou desnecessárias. Estimou-se cerca de 9%- 15%, coisas que não tinham interesse pedir, o que levou a uma atitude clínica. No laboratório também tinham um erro ainda bastante grande, às fases que compõem a fase pré-analítica. As consequências destes erros vão interferir na análise, posso ter um equipamento muito bom, com os melhores reagentes do mercado para o teste que eu pretendo fazer, mas se de facto ele vem com um erro de uma fase anterior, o resultado vai ficar afetado. A extensão do erro muitas vezes é negligenciada, ou não nos conseguimos aperceber do erro. Felizmente grande parte destes erros caem dentro da faixa da normalidade e portanto não têm consequências, mas há cerca de 25% desses erros, em uns que são metade por metade, são tão disparatados, que aí nós damos e pedimos uma nova colheita, há outros que não damos por eles e podem ter efeitos prejudiciais para o doente. Isto quer dizer que nem sempre temos habilidade de reconhecer o erro. Os erros mais graves na coagulação, não são muitas vezes cometidos nos ensaios de rotina (PT, APTT, Fib,..), mas são cometidos nos testes de diagnóstico. Porque se o doente vem a uma consulta para um despiste de uma doença, seja hemorrágica, seja trombótica, e se estou a dar um resultado de um défice ou um não défice, leva a que o

clínico tenha atitudes incorretas. Portanto os erros são mais graves nos ditos ensaios especiais. A fase analítica diminuiu os seus erros porque tem novos equipamentos. Hoje em dia já temos material de referência. Antigamente não tínhamos padrões, o que fazíamos era uma pool de plasmas, e independentemente da proteína que fosse, determinávamos que tinha 100%. Atualmente temos materiais de referência, apesar da maior parte deles, ainda não estarem aferidos, relativamente a outros materiais que existem para a clínica, porque é mais difícil a sua extração e a sua padronização, arranjarmos padrões primários, mas para todos os efeitos é rara a proteína que nós temos que não possa ser utilizado um padrão. Estes equipamentos também têm bons controlos de qualidade, e isto leva a que a fase analítica esteja muito bem controlada, o problema é estar dependente da fase préanalítica. Uma das boas práticas da colheita, é pedirmos ao doente para se identificar, e verificarmos se de facto é aquele doente, se as etiquetas e os tubos correspondem mesmo a esse doente. Existem alguns testes da coagulação para diagnóstico de algumas doenças, que exigem uma preparação do doente, aí tem que se avisar o doente. Na rotina normal, a preparação do doente não existe, no entanto não quer dizer que algo não possa afetar os nossos testes de screening. Relativamente à punção, existem regras para colher, e temos que as uniformizar. Antigamente havia um grupo específico para colher testes de coagulação. O transporte é fundamental, e hoje em dia, grande parte das amostras andam a “passear” metade da manhã, e portanto há que saber como é que elas estão acondicionadas. A maior parte das colheitas nos internamentos são feitos pelos técnicos, nas horas mais críticas, ou seja, de manhã, mas depois durante o dia são os enfermeiros, que são quem realiza os maiores erros. Atualmente existem sistemas ótimos no mercado, em que existem aparelhos que se podem por agora nos pisos, e saem logo umas caixinhas com o nº de tubos, ou etiquetas que são precisas, etc,… isto minimiza alguns erros. O ideal é que as punções não sejam traumáticas, existe libertação de material tecidular, que vai estar nos tubos de coagulação, e também é por isso que se pede que a estase não seja durante muito tempo, nem muito forte, porque a própria estase vai provocar anóxia, e portanto começam a libertar-se substâncias do endotélio e vão interferir na coagulação. Não convém serem agulhas muito fininhas, porque provocam hemólise. Os tubos de colheita hoje em dia são todos de plástico. Mas quando fazemos a separação do plasma, não se deve separar para um tubo de vidro. Em coagulação, o tubo de vidro é carregado de cargas, e ativa a coagulação, então ele tem que ser

tratado. Temos que abolir o vidro dos laboratórios de coagulação, se bem que às vezes seja preciso, para provocar a coagulação. O anticoagulante de eleição é o citrato de sódio, existem em duas concentrações. A integridade da amostra, para os testes de rotina, e sobretudo para amostras que sejam transportadas, mantém-se mais quando são colhidos para tubos com 3,2%. Mas é indiferente, o 3.8% de citrato também é correto, não convém é o mesmo laboratório ter a funcionar 3,2% e 3.8%. Cada laboratório deveria verificar as suas faixas de referência, se tenho amostras com uma concentração, outras com outra, vamos ter resultados diferentes. Em situações de border-line é quando se manifestam.. Antigamente pensava-se que o tubo de coagulação deveria ser colhido em último ou a meio, mas não, é o primeiro, porque estamos a colher em sistemas fechados, o vácuo muitas vezes levanta as outras substâncias e aditivos que os outros tubos podem ter, e portanto podem contaminar. Se o risco diz que é para colher por aqui, não posso colher nem acima nem abaixo. Estamos a concentrar ou diminuir os fatores, e portanto podemos ter problemas relativamente ao valor do doente. Se a homogeneização for vigorosa, pode ativar as plaquetas, e portanto ativa a coagulação. Se tivermos microcoágulos obviamente irá afetar os valores. O APTT é o teste de screening que mais facilmente deteta os erros feitos na préanalítica, seja por hemólise, coágulos, má colheita. Neste exemplo, corretamente, ele deveria dar um valor de 45, e com metade da volumetria, ele dá o dobro, 84.2. Se tivéssemos a monitorizar heparina, p.e., o que isto iria provocar é que o médico iria reduzir a dose, e não era para reduzir, provavelmente até seria para aumentar. O efeito da volumetria é extremamente importante, o APTT é sempre o mais afetado, é mais fácil dar pelo erro, do que pelo PT, mas os outros testes são igualmente afetados quando esta volumetria não é cumprida/respeitada. Chegou-se à conclusão que os hematócritos baixos, só mesmo aqueles quase incompatíveis com a vida é que poderiam interferir grandemente nos testes de coagulação. Mas concentrações muito altas de hematócrito, vão fazer com que o plasma fique muito diluído no anticoagulante, e isto deveria ser corrigido. Antigamente pensava-se que tubos de coagulação deveriam ser refrigerados, mas não é assim, têm que estar à temperatura ambiente. Faz menos mal termos um tubo a 30 graus do que tê-lo a 8 graus. Metade dos fatores da coagulação são termolábeis, portanto as alterações de temperatura são prejudiciais para os nosso fatores. Para o TP não é muito importante, é muito estável, durante horas, mesmo sem ser trabalhado, sem ser centrifugado, o APTT não.

O APTT se for para monitorizar a heparina, deveria ser logo centrifugado na 1º hora, para termos a certeza que não temos nenhuma destruição plaquetária, a plaqueta tem PF4, que inibe a heparina. Mas isto também é válido para outros testes que não sejam o APTT, se eu tiver a medir a heparina por um teste colorimétrico, anti-Xa, se tiver o PF4 em circulação, anula a heparina. Ter em atenção os fatores V, VII e vW, que são afetados pelas temperaturas, ou seja, são ativados, e outros destruídos, o resultado final não é correto. Para os anticoagulantes lúpicos (AL), é necessária uma dupla centrifugação, para garantir que estamos a trabalhar em plasma pobre em plaquetas. Um PPP terá que ter sempre menos de 10 000 plaquetas por uL, e portanto temos que garantir isso, porque muitas vezes, com uma única centrifugação não garante isso. O próprio movimento do tubo faz com que haja um levantamento do buffy-coat, e as plaquetas vão para o plasma. Quando se pipeta, o correto deveria ser pipetar ao meio do sobrenadante, mas hoje em dia, os equipamentos não fazem isso, porque estão equipados para alguns erros da pré-analítica, e não colhem ao meio, colhem mais à superfície. Pode ser precisa uma eventual refrigeração, para determinados testes, como a fibrinólise (raramente se faz). As proteínas da fibrinólise têm que estar no frio, porque queremos que não haja nenhuma reação a seguir a colher, quero exatamente aquilo que estou a apanhar, porque elas complexam entre si, e podem dar valores diferentes. Muitas vezes são colhidos, postos em banhos de gelo, e acidificados. Dupla centrifugação não é centrifugar duas vezes o tubo primário, o que tem que se fazer é centrifugar o tubo primário, tirar-lhe o sobrenadante e centrifugá-lo novamente, e retirar o sobrenadante para um tubo terciário, e é esse que deve ir ao equipamento. Deveríamos rejeitar amostras coaguladas, hemolisadas ou ictéricas. No caso dos lipémicos, sobretudo se for por falta de jejum, o jejum na coagulação não é muito importante, mas se tiver um plasma lipémico, pode interferir, mas fazemos. Os ictéricos não devem, porque vão interferir na fase analítica, no caso dos patológicos, temos que ponderar, ver o que o clínico quer, e ponderar se a interferência segundo o que é pedido, terá consequências. Há testes que não fazemos todos os dias, e se não fazemos todos os dias, tem que se guardar. Segundo as guidelines, as amostras devem ser duplamente centrifugadas, e dividir em alíquotas para congelamento. É quase impossível olhar para isto tudo, quando temos muitas amostras. A congelação deve ser feita em alíquotas, e para descongelar, deve ser sempre feito a 37 graus em banho-maria, nunca descongelar à temperatura ambiente, pois iremos ter farrapos de fibrina que poderão entupir as agulhas, poderão eventualmente encurtar

alguns tempos de coagulação, e portanto devem ser feitos em banho-maria, consoante o volume, mas 2/5 minutos chega. Em coagulação, no laboratório, arcas frost-free é impensável, pois os ciclos de descongelação vão fazer com que as amostras possam descongelar. Quanto mais baixa for a temperatura a que guardamos as amostras, mais preservamos a amostra, portanto, maior a longevidade. Houveram pessoas que tentaram armazenar amostras em sangue total, vai haver hemólise. 24 horas à TA, para o PT, não há problema, mas para o APTT há problema. É sempre preferível centrifugar, mesmo que o tubo fique em cima da bancada. Se for no frio, em sangue total, vai haver hemólise. Por vezes recebemos tubos secundários (alíquotas), e olhando para o tubo não sei se aquilo é soro, plasma, que tipo de plasma, etc… e temos que saber distingui-los. Os fatores podem ser todos doseados no soro, com erros enormes, seja por excesso, seja por diminuição. Se tivermos dúvidas de que tipo de amostra é, devemos sempre fazer, quando recebemos outra amostra, ter um parâmetro para fazer. Para os fatores costumamos fazer o PT e o APTT, depende do fator que nos pedem, se for soro, não coagula, nem PT nem APTT, nem fibrinogénio. O não coagular, ou está com uma coagulopatia gravíssima, ou então a amostra é para rejeitar. No caso do EDTA, a única maneira que temos de saber que plasma é, é dosear o cálcio, ou fazer o ionograma, o potássio só, visto que os tubos EDTA são tripotássio, portanto, está aumentado, o cálcio não há, porque foi quelado pelo EDTA. Antigamente, para os AL, utilizavam-se filtros, e chegou-se à conclusão que os filtros retiam fatores, e portanto os tempos também estavam alongados por haver défice de fatores. Isso não se faz, daí se ter adotado a dupla centrifugação. Há equipamentos hoje no mercado que já têm sistema HIL (hemólise, icterícia e lipémia), e são eles que detetam isso, e ao serem programados, ele diz-nos se devemos ou não fazer o teste, se bem que temos sempre a opção de fazer à mesma o teste. Há outro equipamento no mercado que consegue, em determinadas situações, verificar se existem microcoágulos, porque o que acontece é que às vezes temos valores de APTT muito curtos (15-16 seg), vamos à procura dos coágulos, mas muitas vezes são microcoágulos. Há equipamentos que conseguem, utilizando métodos diferentes, detetar se há ou não microcoágulo. No entanto, o que é mais explorado, é o assunto da hemólise. Se for a olho, posso pensar que aquele grau de hemólise não causa ainda interferência, mas aquela já faz, isto não é rigoroso. Temos aqui 4 amostras hemolisadas, e só esta é que me barrou o resultado, se fosse eu a olhar, diria que esta não interferia. O mesmo acontece com a lipémia. Se ultracentrifugássemos, se não fosse uma dislipidémia, se calhar conseguia ter um sobrenadante e dava.

Isto depende também dos reagentes, porque nem para todos os reagentes, a concentração em lípidos ou Hb, é igual. Mesmo antes de haver este sistema HIL, que lê a hemólise, icterícia e a lipémia, eles já criavam uma zona de leitura que “fugisse” aos erros da hemólise e lipémia, quando fazem os testes. Há uma pré-leitura, e essa leitura vai-nos indicar onde é que eles devem ser lidos, para fugir às interferências da cor, da densidade ótica. Isto é o que os novos equipamentos têm, este sistema HIL. Isto é uma amostra lipémica, e estes traços é o que o equipamento, para os reagentes que utiliza, diz que apartir daí é interferência, claro que posso dizer que não quero. Isto é uma amostra sem interferências, as leituras estão todas abaixo do cut-off, e a outra é uma amostra lipémica, com interferência. Mas isto tem duas vertentes, não é só interferência do ponto de vista analítico, tem também a ver com a biologia. A hemólise interfere nas reações da coagulação, a lipémia também interfere nas reações da coagulação, ativa o fator VII, há outras substâncias que são transportadas por lípidos, que também vão ser consumidas por isso. A icterícia é a única que não está descrita em nenhuma interferência biológica. Ainda não se conhece qual a interferência da icterícia/bilirrubina nos testes de coagulação. Só em termos óticos, cor. Mas a hemólise e a lipémia não é só, de facto, a leitura ótica, tem interferência biológica. Existe agora outro numero de fatores, que os gestores da qualidade não sabem onde é que vão colocar. As faixas de referência, na coagulação temos que determinar as faixas de referência. Não foi feita no equipamento em que estávamos a trabalhar, não foi feita nas mesmas condições de temperatura, a população não é a mesma. Portanto, temos que verificar se essas faixas são corretas ou não. Isto é um problema analítico e pré-analítico, pois se tiver uma má colheita, também vão influenciar os valores da faixa. Ter em atenção também estas variáveis que são inerentes à pessoa, que são importantes na faixa, mas também na validação biopatológica. Se tiver a valorizar cardiolipinas, a partir dos 60 anos, o valor do cut-off sobe, costuma-se multiplicar por 10 a idade do doente, e a partir daí é que é o cut-off. Existe uma destruição celular, e portanto vai aumentar os valores de cardiolipinas. O INR, como é que foi determinada a minha média geométrica para a determinação do INR. Temos que ter os dois sexos, tenho que saber se estão a fazer medicação, para fazer uma boa média, e ter um INR fiável. A atividade física é importante nalgumas proteínas, nomeadamente da fibrinólise, que podem influenciar os resultados de fibrinólise. Os valores de fibrinólise de manhã e à tarde não são os mesmos.

Doentes que estão anticoagulados, podemos não saber que são. Até o painel de seleção do método poderá ser importante.´ Isto são os efeitos dos anticoagulantes que hoje se utilizam no mercado, e os efeitos que eles têm nos testes. Não têm significado clínico estes pequenos aumentos que se encontram. O médico não pode monitorizar nada com este teste, mas no fundo alteram o valor. Isto são situações e são importantes, e que devemos ter atenção quando se trabalha em coagulação, e que poderão estar dentro da pré-analítica ou não, mas acho que envolve as 3 fases. Situações que interferem sobretudo na pós-analítica, quando o patologista está a validar. O técnico quando faz a primeira validação tem que se aperceber disto também. Se não conhecemos o doente, faz-se um teste de screening, PT e APTT, são os únicos testes que nos avaliam facilmente a coagulação, e que indica logo se vale a pena continuar com os testes. Os testes muitas vezes são inconclusivos numa primeira abordagem. Biologia Vascular e Alterações das Plaquetas As plaquetas aparentam...