Hitungan Cawan PDF

Preview

Summary

LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI FARMASI HITUNGAN CAWAN Rabu, 8 April 2015 Kelompok II Rabu, Pukul 10.00 – 13.00 WIB Nama NPM Tugas Amelia Suci P 260110130042 Teori dasar, Daftar Pustak. Nur Alfi K. D 260110130043 Editor, Tujuan, Prinsip, Alat dan Bahan, Prosedur. Iman Firmansyah 260110130044 Pembahas...

Description

LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI FARMASI

HITUNGAN CAWAN Rabu, 8 April 2015 Kelompok II Rabu, Pukul 10.00 – 13.00 WIB Nama

NPM

Tugas

Amelia Suci P

260110130042

Teori dasar, Daftar Pustak.

Nur Alfi K. D

260110130043

Editor, Tujuan, Prinsip, Alat dan Bahan, Prosedur.

Iman Firmansyah

260110130044

Pembahasan, Simpulan.

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI FARMASI FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS PADJADJARAN 2015

\

Nilai

TTD

HITUNGAN CAWAN I. Tujuan

Melatih melakukan pengenceran serial dan menentukan konsentrasi suspensi bakteri dengan metode hitungan cawan.

II. Prinsip 1. Teknik hitung cawan

Jika sel mikroba yang masih hidup di tumbuhkan pada medium agar, maka sel mikroba akan berkembang biak dan membentuk koloni yang dapat dilihat langsung dan dihitung dengan menggunakan mata telanjang tanpa harus dengan menggunakan mikroskop ( Fardiaz,1992). 2. Metode pengenceran

Penambahan pelarut, sehingga jumlah mol zat terlarut sebelum pengenceran sama dengan jumlah mol zat terlarut sesudah pengenceran (Pleczar, 2006). 3. Teknik aseptis

Proses tanpa kontaminasi untuk menjamin preparasi bebas dari mikroba kontaminan, teknik aseptis digunakan sepanjang percobaan berlangsung, baik alat, bahan, lingkungan sekitar maupun praktikan. Untuk alat dan bahan dapat diterapkan metode sterilisasi (Anton,2008). 4. Inkubasi

Suatu teknik perlakuan bagi mikroorganisme yang telah diinokulasikan pada media (padat atau cair), kemudian disimpan pada suhu tertentu untuk dapat melihat pertumbuhannya. Bila suhu inkubasi tidak sesuai dengan yang diperlukan, biasaanya mikroorganisme tidak dapat tumbuh dengan baik (Suriawiria, 2005).

III. Teori dasar

Bakteri adalah domain yang terdiri dari makhluk hidup yang tidak memiliki membran inti (prokariota). Bakteri dulu terbagi menjadi Bacteria dan Archaebacteria, namun sekarang Archaebakteria memiliki domain sendiri yang disebut Archaea. Bakteri memiliki ciri-ciri antara lain tidak memiliki membran inti, tidak memiliki organel bermembran, memiliki dinding sel peptidoglikan, dan materi asam nukleatnya berupa plasmid (Postlethwait dan Hopson, 2006). Dalam tumbuh kembang bakteri baik melalui peningkatan jumlah maupun penambahan jumlah sel sangat dipengaruhi oleh beberapa faktor, yakni seperti ph, suhu temperatur, kandungan garam, sumber nutrisi, zat kimia dan zat sisa metabolisme (Daniel, 2008). Ada beberapa metode untuk menginokulasi bakteri sesuai dengan jenis medium tujuannya. Pada medium agar tegak, dilakukan metode tusuk menggunakan jarum ose. Pada medium agar miring, dilakukan metode gores dengan menggunakan loop ose. Pada medium petridisk, dapat digunakan metode streak plate (metode gores), pour plate (metode tuang) atau spread plate (metode sebar) Setelah inokulasi, dilakukan proses inkubasi, yaitu menyimpan medium pada alat atau kontainer ada temperatur tertentu dan periode tertentu, sehingga tercipta lingkungan yang menyediakan kondisi cocok untuk pertumbuhan bakteri (Harley dan Presscot, 2002). Dalam

metode

perhitungan

cawan,

bahan

yang

diperkirakan

mengandung lebih dari 300 sel mikroba per ml atau per gram atau per cm. Perlakuan pengenceran sebelumnya ditumbuhkan pada medium agar di dalam cawan petri. Setelah inkubasi, akan terbentuk koloni pada cawan petri tersebut dalam jumlah yang dapat dihitung, dimana jumlah yang terbaik antara 30 - 300 koloni. Pengenceran biasanya dilakukan secara desimal, yaitu 1 : 10, 1 : 100, 1 : 1000, dan seterusnya (Waluyo, 2007). Secara kuantitatif koloni bakteri dapat dihitung dengan cara menghitung populasinya secara umum atau dengan kata lain menghitung

seluruh sel bakteri yang ada dalam media termasuk sel yang mati, dan menghitung sel bakteri hidup dengan menggunakan teori pendekatan. Teknik perhitungan cara pertama relatif mudah dilakukan, karena pada cara yang kedua jumlah koloni yang dapat dihitung sangat tergantung dari aktivitas bakteri dalam media pertumbuhannya. Walaupun demikian kedua cara perhitungan ini sering dipakai sesuai dengan tujuan percobaannya (Oktavia, 2008). Pengenceran dilakukan dengan menambahkan larutan, sesuatu yang berbentuk cair ke dalam medium yang akan dibiakan. Di dalam cara perhitungan ini,kerapatan pertumbuhan koloni harus dipertimbangkan. Jika pertumbuhan terlalu rapat, hasilnya akan sulit dipertanggungjawabkan. Demikian juga untuk pertumbuhan yang terlalu jarang sehingga diperlukan pemilihan cawan petri yang pertumbuhan koloni kumannya paling layak untuk dihitung, yang biasanya diambil dari cawan petri yang pertumbuhan koloninya berkisar 30 - 300 koloni per cawan petri (Setiyono, 2013). Tujuan dari pengenceran bertingkat yaitu mengurangi jumlah mikroba yang tersuspensi dalam cairan. Penentuan banyaknya tingkat pengenceran tergantung kepada perkiraan jumlah mikroba dalam sampel. Perbandingan 1 : 9 digunakan untuk sampel dan pengenceran pertama dan selanjutnya, sehingga pengenceran berikutnya mengandung 1/10 sel mikroorganisme dari pengenceran sebelumnya. (Pelczar,2006). Setelah melakukan pengenceran, suspensi bakteri selanjutnya dapat dibiakkan. Membiakkan mikroorganisme dapat dilakukan dengan berbagi cara, salah satunya dalam media cawan Petri. Pengembangbiakan dalam media cawan Petri ini terdiri dari beberapa metode, salah satunya adalah metode cawan tuang (pour plate). (Setiyono,2013). Metode pengukuran pertumbuhan mikroorganisme dapat dibedakan menjadi metode langsung dan tidak langsung. Contoh metode langsung hitungan mikroskopik (menggunakan hemositometer), digunakan untuk mengukur pertumbuhan bakteri pada susu / vaksin dan hitungan cawan

digunakan untuk mengukur pertumbuhan bakteri susu, air, makanan, tanah, dan lain-lain. Contoh metode tidak langsung adalah sebagai berikut: 1. Berdasarkan kekeruhan, bila suspensi biakan cair & homogeny 2. Berdasarkan berat kering sel, bila suspensi biakan kental & tidak homogeny 3. Berdasarkan kadar nitrogen, bila suspensi biakan kental & tidak homogeny 4. Berdasarkan aktivitas biokimia, menggunakan uji mikrobiologis (Hamdiyati, 2011). Hitungan mikroskopik menggunakan ruang penghitung hemositometer mempunyai kelebihan cepat dalam pengerjaannya, tetapi mempunyai beberapa kekurangannya, yaitu : tingkat kesalahan tinggi, sel mati bisa terhitung, sel ukuran kecil sulit teramati. Metode ini tidak sesuai untuk sel yang densitasnya rendah. Hitungan cawan dapat dilakukan dengan metode: 1. Cawan sebar (spread plate method) 2. Cawan tuang (pour plate method) Penerapan metode cawan tuang, terlebih dahulu dilakukan: 1. Satu seri pengenceran terhadap sampel 2. Ambil pengenceran tertentu (Hamdiyati, 2011). Perhitungan jumlah koloni dilakukan dengan hitungan cawan (Total Plate Counts) berdasarkan pertumbuhan dapat dilihat langsung tanpa mikroskop. Metode hitungan cawan cukup sensitif untuk menentukan jumlah mikroorganisme yang masih hidup dengan menghitung beberapa jenis mikroorgaisme sekaligus mengisolasi dan mengidentifikasi yang berasal dari suatu mikroorgabisme yang mempunyai penampakan pertumbuhan spesifik. Dengan metode TPC jumlah koloni dalam contoh dihitung sebagai berikut : Koloni per ml atau per gram = jumlah koloni per cawan x 1/FP (faktor pengenceran) Selanjutnya cawan petri yang dipilih dan dihitung mengandung jumlah koloni antara 30-300 (Permana dan Kusmiati, 2007).

Perhitungan koloni untuk menghitung jumlah total pertumbuhan mikroorganisme kapang dan bakteri dilakukan dengan cara pengenceran. Pengertian istilah propagul diberikan bagi kapang sebagai struktur reproduksi dalam bentuk potongan populasi hifa atau miselium. Sedangkan pengertian koloni diberikan untuk bakteri yang diartikan sebagai bagian dari populasi individu mikroorganisme dari jenis yang sama setelah dipisahkan (Permana dan Kusmiati, 2007). Pengukuran pertumbuhan mikroorganisme dilakukan dengan metoda cawan. Prinsip dari metode ini adalah sel mikroba yang masih hidup ditumbuhkan pada medium sedemikian sehingga mikroba tersebut akan berkembang biak dan membentuk koloni yang dapat dilihat langsung dan dihitung tanpa menggunakan mikroskop. Jumlah koloni mikroorganisme dihitung berdasarkan Standard Plate Count (SPC). Metode ini cukup sensitif karena hanya sel mikroorganisme yang hidup yang dapat dihitung. Selain itu beberapa sel yang berdekatan dapat dihitung sekaligus sebagai suatu koloni (Hanafi, et al., 2006). Untuk melaporkan suatu analisis mikrobiologi digunakan suatu standar yang disebut “Standard Plate Count” yang menjelaskan cara menghitung koloni pada cawan serta cara memilih data yang ada untuk menghitung jumlah koloni dalan suatu contoh. Cara menghitung koloni pada cawan adalah sebagai berikut : 1. Cawan yang dipilih dan dihitung adalah yang mengandung jumlah koloni antara 30 sampai 300 2. Beberapa koloni yang bergabung menjadi satu merupakan suatu kumpulan koloni yang besar dimana jumlah koloninya diragukan, dapat dihitung sebagai satu koloni. 3. Suatu deretan koloni yang terlihat sebagai suatu garis tebal dihitung sebagai satu koloni (Dwidjoseputro, 1978). Koloni adalah kumpulan dari mikroba yang memilki kesamaan sifat-sifat seperti bentuk, susunan, permukaan, dan sebagainya. Sifat-sifat

yang perlu diperhatikan pada koloni yang tumbuh di permukaan medium adalah: 1. Besar kecilnya koloni. Ada koloni yang hanya serupa suatu titik, namun ada pula yang melebar sampai menutup permukaan medium. 2. Bentuk. Ada koloni yang bulat, ada yang memanjang. Ada yang tepinya rata, ada yang tidak rata. 3. Kenaikan permukaan. Ada koloni yang rata saja dengan permukaan medium, ada pula yang timbul yaitu menjulang tebal di atas permukaan medium. 4. Halus kasarnya permukaan. Ada koloni yang permukaannya halus, ada yang permukaannya kasar dan tidak rata. 5. Wajah permukaan. Ada koloni yang permukaannya mengkilat, ada yang permukaannya suram. 6. Warna. Kebanyakan koloni bakteri berwarna keputihan atau kekuningan. 7. Kepekatan. Ada koloni yang lunak seperti lendir, ada yang keras dan kering (Dwidjoseputro, 1978).

IV. Alat dan Bahan

A. Alat 1. Cawan petri 2. Erlenmeyer 3. Inkubator 4. Kapas 5. Kompor listrik 6. Korek api 7. Rak tabung 8. Spidol 9. Spiritus 10. Tabung Reaksi 11. Volume pipet 1 mL

12. Volume Pipet 10 mL B. Bahan 1. Aquades 2. Nutrien agar 3. Sampel air bak mandi

C. Gambar Alat

V. Prosedur Kerja

Semua langkah kerja dilakukan dengan cara aseptik. Disetiap tabung diberikan label, tanda agar setiap tabung tidak tertukar. Dilakukan pengenceran pada sampel pada tiap-tiap tabung. Pada tabung a , dilakukan pengenceran sampel dengan konsentrasi 10-1, diambil 1 mL sampel dan ditambahkan dengan 9 mL aquadest, campuran dikocok. Dipipet 1 mL sampel dari tabung a (10-1), dimasukkan ke dalam tabung b, kemudian encerkan pula dengan penambahan 9 mL aquadest, jadi didalam tabung b merupakan sampel dengan konsentrasi 10-2, lalu dikocok. Lalu, sampel pada tabung b dipipet 1 mL dan dimasukkan ke dalam tabung c, lalu diencerkan pula dengan 9 mL aquadest, sehingga di dalam tabung c terdapat sampel dengan konsentrasi 10-3, lalu dikocok. Sampel pada tabung reaksi a, b dan c dipipet ke dalam cawan Petri, masing-masing sebanyak 1 ml. Dituangkan nutrient agar ke dalam masing-masing cawan Petri yang telah diberi label untuk dapat membedakan konsentrasi sampel, pastikan suhu nutrien agar 450, lakukan pekerjaan di dekat api. Lalu cawan Petri digoyang perlahan di atas meja laboratorium sampai sampel tersebut tersebar merata pada nutrient agar. Ditunggu sampai nutrient agar membeku. Lalu cawan Petri tersebut dibungkus dengan koran dalam posisi terbalik agar uap air yang terdapat pada cawan tidak jatuh ke nutrient agar. Diinkubasikan dalam incubator dengan suhu 37ºC ± selama 24 jam. Diitung koloni bakteri yang tumbuh pada cawan petri tersebut setelah 24 jam.

VI. Data Pengamatan dan Perhitungan

A. Data Pengamatan

Sampel

Pengenceran

Perlakuan

Hasil

Air Bak Mandi

10-1

Diencerkan dengan aquadest 9ml lalu ditambahkan nutrien agar

10-2

Air Bak Mandi

Diencerkan dengan aquadest 9ml lalu ditambahkan nutrien agar

10-3

Air Bak Mandi

Diencerkan dengan aquadest 9ml lalu ditambahkan nutrien agar

B. Perhitungan

No.

PENGENCERAN

JUMLAH KOLONI

1.

10-1

56 koloni

2.

10-2

13 koloni

3.

10-3

7 koloni

Kisaran yang paling tepat dalam menghitung koloni pada cawan adalah 30-300 koloni per cawan. Jika jumlah koloni < 30 atau , maka tidak dimasukkan ke dalam perhitungan.

Jumlah koloni per ml sampel

=

56 ( 10 ) 1

= 560 cfu/ml

VII.

Pembahasan

Pada praktikum kali ini dilakukan penghitungan koloni bakteri pada sampel air bak mandi. Metode yang dilakukan untuk menghitung suatu koloni pada sampel yaitu metode hitungan cawan. Metode ini merupakan analisis untuk menguji cemaran mikroba dengan menggunakan metode pengenceran dan metode cawan tuang. Metode cawan tuang adalah metode per plate. Metode ini dilakukan dengan mengencerkan sumber isolate yang telah diketahui beratnya ke dalam 9 ml larutan garam fisiologis, larutan yang digunakan sekitar 1 ml suspensi ke dalam cawan petri steril, dilanjutkan dengan menuangkan media penyubur (nutrient agar), NA / media penyubur merupakan nutrisi untuk makanan mikroba (Dwidjoseputro, 1989). Prinsip dari metode hitungan cawan adalah jumlah mikroba yang masih hidup ditumbuhkan pada medium agar, mikroba tersebut akan berkembang biak dan membentuk koloni yang dapat dilihat langsung dan dihitung dengan mata tanpa menggunakan mikroskop. Metode hitungan cawan merupakan cara yang paling sensitif untuk menghitung jumlah mikroba (Fardiaz, 1992). Sampel yang digunakan diambil dari air bak mandi dikarenakan Perairan merupakan suatu ekosistem yang banyak mengandung mikroba dengan morfologi dan sifat fisiologi yang berbeda beda. Jumlah koloni mikroba yang terdapat dalam suatu perairan pun beraneka ragam jumlahnya. Bakteri merupakan organisme prokariotik bersel tunggal dengan jumlah kelompok atau koloni paling banyak pada ekosistem perairan (Saraswati 2007). Pertumbuhan juga dapat ditentukan secara tidak langsung dengan metode penuangan (platting) pada media padat. Jumlah sel pada metode penu angan ditentukan dengan menghitung jumlah koloni yang tumbuh dalam

media padat sehingga yang terhitung hanya sel-sel yang masih hidup. Metode yang dipergunakan dalam menghitung bakteri kali ini adalah metode cawan sebar dan metode cawan tuang dengan pengenceran sampel terlebih dahulu. Metode penyebaran (Spread Plate Method) dilakukan dengan cara menyebarkan sampel yang telah diencerkan diatas permukaan pelat agar dalam cawan petri, sedangkan metode penuangan (Pour Plate Method) merupakan metode penghitungan mikroba dengan mencampurkan sampel pada media agarcair (Harmita, 2008). Metode penyebaran lebih efektif dalam perhitungan cawan karena bakteri dapat tersebar merata ke seluruh cawan dengan minimnya penumpukan tetapi resiko terkena kontaminannya tinggi. Sedangkan cawan tuang cenderung sulit dilihat koloninya jika penuangannya tidak sempurna dengan adanya koloni yan bertumpuk. Pertama yang dilakukan adalah pengenceran sampel sebanyak 3 kali dengan perbandingan 1 : 10. Pengenceran dilakukan dengan memindahkan sampel menggunakan volume pipet yang ujungnya diberi penyumbat kapas sebanyak 1 ml kedalam tabung reaksi yang berisi aquades steril sebanyak 9 ml. Dilakukan 3 kali pengenceran yaitu 10-1, 10-2, dan 10-3. Pemberian sumbat kapas pada ujung volume pipet berfungsi untuk menghindari kontaminasi dari mulut ke dalam sampel pada saat pemindahan / pengenceran sampel. Pentingnya melakukan pengenceran pada metode plating adalah untuk mengantisipasi munculnya TNTC / TBUD dan TFTC. Karena apabila pengenceran yang di lakukan terlalu tinggi, maka koloni yang terbentuk hanya sedikit. Sedangkan apabila pengenceran

kita di lakukan terlalu

rendah, maka kecenderungan menghasilkan TNTC / TBUD akan lebih besar. Koloni yang terbentuk cenderung tumbuh bertumpuk-tumpuk juga sampai tak bisa dihitung (Hadiutomo, 1990). TNTC adalah singkatan dari Too Numerous To Count, sedangkan TBUD adalah singkatan dari Tidak Bisa Untuk Dihitung. Ini adalah kondisi dimana koloni

yang

terbentuk

pada

media terlalu

banyak

sampai

tidak memungkinkan untuk dihitung, jumlah koloni telah melewati batas penghitungan 30-300. Hal ini dapat terjadi karena faktor pengencerannya masih rendah sehingga konsentrasi bakteri di dalam suspensi masih banyak. Bisa juga karena penyebaran yang kurang merata sehingga membuat bakteri tumbuh secara bertumpuk dan susah dihitung. Hal ini dapat diatasi dengan membuat pengenceran yang lebih tinggi lagi dan lebih memperhatikan homogenisasi di setiap penginokulasian. Namun hal ini bisa juga terjadi karena adanya kontaminan yang masuk ke dalam media dan ikut berproses (Barazandeh, 2008). Kelemahan metode pengenceran adalah keselektifan hasil perhitungan yang kadang menjadi bias. Kondisi pertumbuhan kontaminan, termasuk komposisi media yang digunakan, waktu inkubasi, suhu dan pH sangat menentukan bakteri yang dapat tumbuh dari seluruh populasi yang ada (Harmita, 2008). Pada saat pemindahan sampel, dilakukan di dekat api supaya steril dari kontaminan. Sterilisasi yaitu proses mematikan semua mikroorganisme dengan pemanasan, dengan tujuan untuk membebaskan bahan dari semua mikroba perusak (Anton, 2003). Kemudian sampel yang sudah diencerkan dimasukan kedalam cawan petri sesuai dengan pengencerannya yaitu 10-1, 102

, dan 10-3 sebanyak 1 ml. Setelah larutan sampel berada pada cwan petri,

kemudian sampel di campur dengan media agar, lalu di homogenkan supaya baktri tersebar pada cawan petri secara merata. Setelah itu di inkubasi selama 24 jam dengan suhu kamar sekitar 35 – 37o C. Metode penghitungan cawan menggunakan media agar karena apabila koloni tumbuh pada media agar akan lebih mudah mengamatinya. Berbeda apabila menggunakan media broth. Pada media broth akan lebih sulit dalam menghitung koloni karena bentuknya adalah cair. Apabila bentuknya padat seperti agar, maka akan lebih mudah menghitungnya (Hadiutomo, 1990). Suhu yang di gunakan pada saat inkubasi adalah suhu kamar sekitar 35 – o

37

C karena suhu inkubasi tersebut sudah sangat sesuai dan dapat

mendukung pertumbuhan mikroba dengan sangat baik. Suhu tersebut sangat

disukai mikroba, oleh karena itu mereka jadi lebih cepat tumbuh dan berkembang biak. Apabila suhu tersebut dinaikkan, maka mikroba tersebut bisa mati atau terdenaturasi kecuali mikroba yang memang bersifat thermophilik. Dan apabila suhu tersebut diturunkan, mikroba tersebut juga akan mati karena tak tahan suhu dingin dan akan rusak karena enzimnya telah inaktif (Pelczar, 2006). Dari hasil inkubasi didapatkan bakteri pada setiap cawan petri. Pada cawan petri 10-1 di dapatkan koloni bakteri sebanyak 56 koloni, cawan petri 10-2 didapatkan koloni bakteri sebanyak 13 koloni, dan cawan petri 10 -3 di dapatkan koloni sebanyak 7 koloni dan 1 koloni jamur. Dari hasil di atas sesuai dengan literatur yaitu semakin tinggi pengenceran maka jumlah koloni semakin sedikit. Pada cawan petri 10-3 Terdapat satu koloni jamur, hal tersebut dapat terjadi karena pengerjaan yang kurang aseptis pada saat memindahkan atau memasukan sampel pada cawan petri. Dilihat dari hasil di atas cemaran bakteri pada air bak mandi tidak terlalu tinggi, dengan hasil rata – rata bakteri pada cawan adalah 560 CFU/ml. Banyaknya bakteri yang terkandung dalam suatu perairan dapat menjadi indikator kualitas suatu perairan. Bakteri tersebut dapat mempengaruhi sifat fisik dan sifat kimia suatu perairan. Bakteri perairan dapat...