Hochleistungsflüssigchromatographie PDF

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Protokoll zum Praktikum HPLC...

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Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) Einleitung und Theorie Die Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) ist eine chromatographische Trennmethode. Die Komponenten eines Stoffgemisches sollen mittels einer mobilen flüssigen und einer stationären festen Phase voneinander getrennt werden. Es handelt sich um eine Säulenchromatographie, die mobile Phase (auch Laufmittel oder Fließmittel genannt) und die Proben werden also mit hohem Druck durch eine Säule gepumpt, welche die stationäre Phase bildet. Der Trennvorgang beruht auf den Wechselwirkungen der einzelnen Komponenten mit den Phasen. In diesem Experiment wird eine Reversed-phase HPLC durchgeführt, das bedeutet die stationäre Phase ist unpolar (Multospher 120 RP) und die mobile Phase polar (30% Methanol 70% Wasser). Somit werden unpolare Komponenten der Probe später eluiert als polare, da sie stärker mit der ebenfalls unpolaren stationären Phase wechselwirken. Damit basiert der Trennprozess auf Wechselwirkungen und Polarität, aber auch die Zusammensetzung der mobilen Phase hat einen Einfluss auf die Art und Anzahl der Analyten. Man unterscheidet die isokratische Elution, bei der über die gesamte Analysezeit ein Laufmittel mit gleichbleibender Zusammensetzung verwendet wird, und die Gradientenelution, bei der die Zusammensetzung des Fließmittels während der Analyse verändert wird. In diesem Praktikum wird die isokratische Elution verwendet. Um die Einzelkomponenten der Probe am Ende der Chromatographie quantitativ und qualitativ zu bestimmen, ist ein Standard nötig. Hier wird ein interner (innerer) Standard verwendet. Der interne Standard sollte dem Analyten ähnlich sein und dementsprechend ähnliche Eigenschaften besitzen, jedoch darf er nicht der Analyt selbst sein. Da Koffein der Analyt in diesem Experiment ist, wird Theophyllin als Standard verwendet. Er wurde der Probe vor dem ersten Probenvorbereitungsschritt zugegeben und durchläuft daher die gesamte Aufbereitung, das hat den Vorteil, dass ein Verlust durch Überführung oder Verdünnungsfehler den Standard genauso betreffen wie die Probe. Würde man den Standard nachträglich dazu geben, so wäre der Standard auf die Anfangskonzentration der Probe bezogen, die aber nach der Aufbereitung abweicht. Somit ist der interne Standard besonders für komplizierte Probenvorbereitungen, bei der viele Fehler passieren können, sehr gut geeignet. Aufgabenstellung und Durchführung Ziel des Experiments ist es, die Koffeinmenge in Tee mit Hilfe des internen Standards quantitativ zu bestimmen. Dafür werden drei Teeproben mit unterschiedlichen Ziehzeiten (1min, 2min, 5min) mithilfe der HPLC analysiert. Zuerst werden 24,6 mg des Standards in ein Becherglas gegeben in das 200mL kochendes Wasser dazu gegeben werden. Danach werden drei Teebeutel in den das Wasser gegeben. Nach jeweils einer, zwei und fünf Minuten werden circa 3mL Tee entnommen. Die Proben werden auf Raumtemperatur abgekühlt, dann werden 2mL jeder Probe in einen 50mL Messkolben pipettiert und mit Reinstwasser aufgefüllt. Die nun verdünnten Proben werden dann mit einer Einwegspritze durch einen Filter in HPLC Vials überführt. Außerdem wird ein weiteres Vials mit der Standardlösung befüllt, welche 5 mg/L Theophillin und 10 mg/L Koffein enthält. Nachdem die Probenvorbereitung abgeschlossen ist, werden die Vials in die Probenkammer des HPLC Geräts gestellt. Auf der Maschine stehen die Fließmittelbehälter, über eine Zuleitung wird das Fließmittel zur HPLC Pumpe geleitet, von dort aus gelangt es zum Injektor. Die Probe wird automatisch aus der Probenkammer in den Injektor gegeben und gelangt zusammen mit dem Fließmittel in die Säule. Hat es die Säule durchlaufen registriert der Detektor das Signal und leitet es an einen PC mit geeigneter Software zur Messdatenverarbeitung weiter. Laufmittel und Probe werden in einen Abfallbehälter

weitergeleitet (Dies ist jedoch nicht immer der Fall, denn die durch HPLC getrennten Substanzen können in anderen Fällen zur weiteren Untersuchung aufgefangen werden). Als Detektor wird hier ein UV Detektor verwendet, welcher die Lichtadsorption mit Fotodioden misst und als elektrisches Signal an den PC weiter leitet. Die Detektionswellenlänge liegt bei 272nm außerdem wird auch noch mit einer Referenzwellenlänge von 360nm gemessen. In dieser Wellenlänge adsorbiert der Analyt nicht, wenn also Adsorption vorliegt, bedeutet das, dass nur die Matrix, also die anderen Bestandteile des Tees bei dieser Wellenlänge adsorbieren können. Damit lässt sich eine Untergrundmessung durchführen, um die Adsorption der Restbestandteile von der Adsorption des Analyten zu unterscheiden. Ergebnis der Chromatographie ist ein Chromatogramm. Die adsorbierte Wellenlänge wird als Funktion der Zeit angegeben. Die Signale der Probenkomponenten haben im Idealfall die Form einer Gaußverteilung und werden Peaks genannt. Auswertung und Ergebnisse Ergebnisse der HPLC: Probe Standardlösung 1 Minute Ziehzeit 2 Minuten Ziehzeit 5 Minuten Ziehzeit

Peakfläche Peak 1

Peakfläche Peak 2 178,66 152,76 155,93 152,91

288,18 71,17 144,00 209,10

graphische Darstellung der Daten 350 300 250 200 150 100 50 0 Standardlösung

1 Minute Ziehzeit 2 Minuten Ziehzeit 5 Minuten Ziehzeit Peakfläche Peak 1

Peakfläche Peak 2

In der oberen Graphik werden die Ergebnisse der HPLC dargestellt. Der blaue Balken und somit die erste Peakfläche entspricht dem Theophyllin, da es der Retentionszeit des Theophyllins aus der Standardlösung entspricht und in den Proben nicht mit zunehmender Ziehzeit auch steigt sondern konstant bleibt. Es ist also kein Stoff aus der Probe sondern der interne Standard. Der rote Balken/ die zweite Peakfläche entspricht dem Koffein. Es besitzt die gleiche Retentionszeit wie das Koffein in der Standardlösung und wird daher für Koffein gehalten. Außerdem steigt die Menge des Stoffes mit steigender Ziehzeit an, es ist also Bestandteil des Tees. Die Zunahme an Koffein im Tee ist innerhalb von einer Minute Ziehzeit sehr hoch, nimmt jedoch mit der Zeit ab. Es findet immer noch ein Anstieg statt, jedoch ist dieser schwächer als in den ersten 2 Minuten. Keine Ahnung was man da noch schreiben kann und welches Diagramm kannst du dir aussuchen, ich fand das mit den Balken mal eine schöne Abwechslung aber das findet sie glaube ich nicht so gut oder? :O

graphische Darstellung der Daten Peakfäche in mAU*s

250 200 150 100 50 0 0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

Ziehzeit in Minuten

Diese Graphik stellt die Messergebnisse der HPLC dar. Man erkennt, dass mit steigender Ziehzeit auch die Koffeinkonzentration (proportional zur Peakfläche) steigt. Auch erkennt man, dass die Steigung in den ersten 2 Ziehminuten höher ist, als danach. Hier ist dann nur kein Standard dabei :o Berechnung des Kalibrierfaktors mittels Standardlösung:

KF=

β ( Analyt)× S(internen Standard) β ( interner Standard ) × S ( Analyt)

β = Konzentration in der Standardlösung S= Signal in der Standardlösung

mg ×288,18 mAU × s L KF= mg 5 ×178,66 mAU × s L 10

KF=3,23 Der Kalibreirfaktor ist notwendig, um die Abweichungen der Ist- von der Soll-Konzentration auszugleichen. Theoretisch ist die Konzentration des Koffeins in der Standardlösung doppelt so groß, wie die des Theophyllins, daher sollte die Peakfläche des Koffeins auch doppelt so groß sein, wie die des internen Standards. Dies entspricht jedoch nicht dem realen Ergebnis. Daher muss, bevor die Konzentration des Analyten in der Probe berechnet wird, der Kalibrierfaktor zur Korrektur dieser Abweichung berechnet werden. Koffeinkonzentration in der Probe mit 5 Minuten Ziehzeit:

β ( Analyt )=KF × β= Konzentration S= Signal KF = Kalibrierfaktor

S (Analyt ) × β(interner St andard) S(interner Standard)

β ( Analyt )=3,23 × β ( Analyt )=22,09

209,10 mAU × s mg ×5 152,91 mAU × s L

mg L

Die Konzentration des Analyten in der Teeprobe mit 5 Minuten Ziehzeit beträgt 22,09 mg/L. Koffeingehalt des Teebeutels: Der Inhalt von drei Teebeuteln wurde eingewogen und daraus wurde ein Mittelwert erstellt. Ein Teebeutel enthält 1,8762g Tee.

Masse m=Konzentrationc × Volumen V m(Koffein)=22,09

mg ×1L L

m(Koffein)=22,09 mg Koffeingehalt=

22,09 mg mg =11,77 g 1,8762 g

Ein Teebeutel enthält rund 11,77 mg/g Koffein....