IMUNODIFUSÃO RADIAL SIMPLES (IDR) EM GEL DE AGAROSE PDF

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Relatório de aula prática sobre imunodifusão radial simples em gel de agarose....

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UNIVERSIDADE DO VALE DO PARAÍBA – UNIVAP FACULDADE DE CIÊNCIAS DA SAÚDE – FCS CURSO DE BIOMEDICINA

IMUNODIFUSÃO RADIAL SIMPLES (IDR) EM GEL DE AGAROSE

Imunologia Aplicada à Saúde Biomedicina São José dos Campos 2018

1. Introdução A imunodifusão fundamenta-se na reação de precipitação, em que substâncias solúveis, por movimentos moleculares, se deslocam em meio gelificado, sendo o ágar ou gel de agarose, até encontrar constituintes que promovam sua precipitação. A substância solúvel nesta prática foi o antígeno. Quando livre, essa se difundiu no gel até encontrar os anticorpos que compõem o meio, formando os imunocomplexos de elevado peso molecular. Devido ao seu tamanho e peso, o complexo imune fica imobilizado no gel, precipitando, formando halo ou linha visível. Na técnica de Imunodifusão Radial Simples, são feitos orifícios no ágar para o antígeno ser adicionado em volume preciso. O gel de agarose já apresenta quantidade específica de anticorpo incorporada. Desta forma, o antígeno se difunde no gel até encontrar o anticorpo, formando os imunocomplexos como resultado. Este resultado pode ser observado por meio da formação de um halo no entorno do poço em que o antígeno foi adicionado. Tal técnica permite a análise quantitativa do antígeno da amostra. 2. Objetivo Analisar quantitativamente, através do diâmetro do halo precipitado, a concentração dos anticorpos IgG e IgM, e as frações dos componentes do sistema complemento C3 e C4 presentes na amostra de soro.

3. Metodologia 3.1 Material Utilizado o Kit de placas de imunodifusão radial com gel de agarose acrescido de anticorpos específicos para quantificação das proteínas séricas: IgG, IgM, C3 e C4. o Pipeta (5ul) o Soro humano o Ponteiras o Papel milimetrado

3.2 Procedimento Foram aplicados 5ul de soro humano nos poços de cada placa de gel agarose acrescida de IgG, IgM, C3 e C4. Nesta etapa é preciso atenção para que o soro não fosse derramado fora do poço, uma vez que tal erro pode resultar na formação inexata do halo e, consequentemente, incorreta interpretação do resultado. Além disso, evita-se o contato com o gel para não ocorrer deformação das bordas do poço ou formação de bolhas no entorno. Após o soro ser pipetado no poço de gel agarose, as placas foram fechadas com um pedaço de algodão úmido no interior e armazenadas em uma caixa com béquer e algodão úmido. Tal medida foi feita para garantir que as mesmas se mantivessem úmidas, evitando o ressecamento do gel. A caixa contendo as placas foram mantidas em temperatura ambiente por 24 horas. Após esse tempo, foi feita a leitura de cada placa no período de 48 horas e 72 horas, obtendo a medida dos halos para o resultado. Na imagem 1 é possível visualizar a placa imediatamente após a adição do soro.

Poço para adicionar o soro a ser verificado

Gel de agarose com anticorpos incorporados No caso desta placa, o anticorpo é o anti-IgG

Imagem 1

4. Resultados Após o período de 72 horas é possível verificar a formação do halo em cada placa, caso a reação de precipitação ocorra. O diâmetro do halo é medido em milímetros e comparado às medidas padrão fornecidos pelo fabricante. Por meio disso, é possível construir um gráfico utilizando como base os valores padrão e através da reta resultante e diâmetro do halo, verifica-se a concentração aproximada de antígeno que estava presente na amostra. Os valores do diâmetro dos halos obtidos foram organizados na seguinte tabela:

Não

foi

Antígen o IgM IgG C3 C4

Diâmetro do halo (em milímetros) 6 mm 5 mm 5 mm Não houve formação de halo

possível obter

formação de halo para o antígeno C4. Tal resultado negativo pode decorrer da pipetagem do soro em valor inferior ou incorreto do exigido. Para a construção dos gráficos relativos a C3, C4, IgG e IgM foram utilizados valores padrão que relacionam o diâmetro do halo com a concentração do antígeno, fornecidos pelo fabricante do kit.

C3

C4

IgG

No gráfico, o eixo X (abscissas) diz respeito à concentração do antígeno em mg/dL, já o eixo Y (ordenadas) é o diâmetro ao quadrado na unidade milimetro ao quadrado (mm²). Após a construção dos gráficos, que estão em anexo no final do relatório, os resultados obtidos foram os seguintes: Antígen o IgM IgG C3 C4

Diâmetro do halo (em milímetros)

Concentração antígeno (em mg/dL)

6 mm 5 mm 5 mm Não houve formação de halo

120 mg/dL 600 mg/dL 90 mg/dL ------------

5. Conclusão Comparando as concentrações do antígeno obtidas pelo gráfico da dupla com os valores de referência fornecidos pelo fabricante, pode-se concluir que o soro do indivíduo analisado apresentou baixa concentração de IgG e valores de normalidade para IgG e IgM. Deve-se ressaltar que o valor de C4 não foi avaliado, uma vez que houve erro de pipetagem.

6. Questões 1) Para cada item pesquisado, construa um gráfico, em papel milimetrado, com os valores de referência e encontre a concentração dos componentes séricos analisados. Os gráficos estão em anexo no relatório e as concentrações encontradas foram colocadas na seguinte tabela: Antígen o IgM IgG C3 C4

Diâmetro do halo (em milímetros) 6 mm 5 mm 5 mm Não houve formação de halo

Concentração antígeno (em mg/dL) 120 mg/dL 600 mg/dL 90 mg/dL ------------

2) Cite e explique as principais forças de atração numa reação antígenoanticorpo. Defina Afinidade e Avidez. A interação de um anticorpo com um antígeno é feita pelo somatório de forças intermoleculares não-covalentes na região entre o epítopo e sítio combinatório, tais como pontes de hidrogênio, ligação hidrofóbica, forças de Van der Waals e pontes eletrostáticas.  Pontes de Hidrogênio: hidrogênio compartilhado entre átomos eletronegativos como o nitrogênio e o oxigênio.  Ligação hidrofóbica: grupos hidrofóbicos interagem desfavoravelmente com a água e tendem a se agrupar para exclusão de moléculas de água.  Forças de Van der Waals: flutuações nas nuvens de elétrons ao redor das moléculas polarizam os átomos vizinhos.  Pontes eletrostáticas: atração entre átomos ou moléculas de carga oposta. A afinidade do anticorpo é a força da reação entre um determinante antigênico e um sítio combinatório do anticorpo, sendo elas reversíveis, ela descreve a reação antígeno-anticorpo. Já a avidez do anticorpo, é o conjunto das forças de ligação entre os vários determinantes do antígeno com a multivalência dos anticorpos, pode-se dizer que é a somatória de todas as afinidades. 3) Na reação que você fez, por que forma–se um halo de precipitação? Esquematize a reação Ag-Ac representando o que aconteceu na reação de precipitação.

Devido ao menor peso molecular do antígeno, ocorre a sua difusão no gel agarose, até que ele encontre o anticorpo incorporado no gel, formando o imunocomplexo com maior peso molecular, que sofre precipitação. À medida que mais antígeno se difunde, maior quantidade de precipitado se forma, até que todo antígeno seja difu s, isto é, o tempo d

4) Diferencie imunodifusão simples da imunodifusão dupla. Na imunodifusão simples, ou o antígeno ou o anticorpo é incorporado no ágar. Como fizemos na aula prática, o anticorpo (IgG ou IgM) estava incorporado e foi depositado o antígeno nos orifícios da placa, para que somente o antígeno corresse no gel e formasse a reação, isto é, o halo em torno dos orifícios com antígenos. Logo, pode-se dizer que somente o antígeno ou o anticorpo irá se difundir pela placa. Já na técnica de imunodifusão dupla, o antígeno e o anticorpo se difundem para todas as direções, também a partir de orifícios no meio gelificado. Após ambas se difundirem, eles se encontram formando linhas ou arcos de precipitação. A técnica permite a comparação simultânea, como de vários sistemas antigênicos contra

somente

um antígeno, ao

contrário

da

imunodifusão radial simples, que permite uma interação específica entre um único anticorpo com o antígeno. 5) Qual a influência da concentração de Ags e de Acs na formação dos precipitados? A quantidade de antígenos e anticorpos influenciam na formação do precipitado. No caso da imunodifusão simples realizada em aula, quanto maior a concentração de antígeno no soro, maior será o halo formado, uma vez que grande quantidade de antígeno conseguirá se difundir pelo gel. A zona de equivalência será atingida mais lentamente. Já a quantidade de anticorpos incorporados no gel durante a imunodifusão simples, quanto maior a concentração menor será o halo formado. Isto ocorre

devido a elevada quantidade de anticorpos se juntou com o antígeno antes deste ter tempo de se difundir em uma maior área. A zona de equivalência será atingida de forma mais rápida.

7. Referências bibliográficas MALE, David et al. Imunologia. Elsevier Brasil, 2014.

VAZ, Adelaide José; TAKEI, Kioko; BUENO, Ednéia Casagranda. Imunoensaios: fundamentos e aplicações. In: Imunoensaios: fundamentos e aplicações. 2014.

JANEWAY, C. et al. Imunobiologia. 5ª edição. 2002....