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Isoelektrische Fokussierung Hintergrundwissen

Isoelektrische Fokussierung

Die isoelektrische Fokussierung ist eine gelektrophoretische Trennungsmethode.! Bei der isoelektrischen Fokussierung wird im Gegensatz zu der klassischen Gelelektrophorese ein linearer pH-Gradient aufgebaut.! Erzeugt wird dieser durch Zugabe von zahlreichen Trägerampholyten, die sich alle minimal in ihrem isoelektrischen Punkt unterscheiden.! Bei Anschluss des elektrischen Feldes ordnen sich sich entlang ihrer pI an.! Abbildung 1, vgl. Müller-Esterl, 2018, p.91 Isoelektrische Fokussierung

Die Probe wird mit Harnstoff und ßMercaptoethanol denaturiert und auf das Polyacrylamid-Gel aufgetragen.! Nach Anschluss des elektrischen Feldes beginnen sich die Proteine der Probe entlang des Gels in Richtung Anode bzw. Kathode zu bewegen. Sobald der isoelektrische Punkt erreicht ist, beträgt die Nettoladung 0 und die Bewegung der Proteine wird gestoppt.! Abbildung 2, vgl Stryer, 2018, p.89

SDS PAGE+ isoelektrische Fokussierung = 2D-Gelektrophorese

SDS PAGE

Denaturierung von Proteinen mittels SDS (sodium dodecyl sulfate) und Bildung eines SDSProtein-Komplex, der nach außen negativ geladen ist.! Gelektrophoretische Auftrennung auf einem Polyacrylamid-Gel. $ Wanderung der Proteine von Kathode zur Anode entlang des elektrischen Feldes.$ Trennungskriterium hierbei ist die unterschiedliche Molekulare Maße der einzelen Proteine

Abbildung 3, vgl. Müller-Esterl 2018, p.90 SDS-PAGE

2D-Gelektrophorese

1. Dimension - Isoelektrische Fokussierung Trennung der Proteine nach unterschiedlichen pH-Werten in der Horizontalebene! 2. Dimension - SDS PAGE! Trennung der Proteine nach ihrem Molekulargewicht in der Vertikalebene!

Kombination von SDS-PAGE und isoelektrische Fokussierung erlaubt eine Differenzierung zwischen über 1000 verschiedenen Proteinen

Abbildung 4, vgl. Löffler/Petrides, 2014, p.90 2D-Gelelektrophorese...