Kinetyka działania enzymów PDF

Preview

Summary

Kinetyka działania enzymów opracowane zagadnienia....

Description

Kinetyka działania enzymów 1. Co to jest stała Michaelisa? Do czego służy? Stała Michaelisa – Km – to takie stężenie substratu, przy którym szybkość reakcji enzymatycznej jest równa połowie szybkości maksymalnej – Vmax tej reakcji. Wyrażana jest w molach na dm3 i określa powinowactwo enzymu do substratu: im jest mniejsza, tym powinowactwo większe, a duża wartość tej stałej mówi o małym powinowactwie enzymu do substratu. Przedział 10-5 – 10-3 mol/dm3. Km= [S] v=

Vmax [ S] Km+[ S]

Przy stałym stężeniu enzymu, szybkość reakcji w pewnych granicach zależy od stężenia substratu, na wykresie zależności szybkości reakcji od stężenia substratu: - przy niewielkim stężeniu substratu w stosunku do stężenia enzymu – zależność liniowa między stężeniem substratu a szybkością reakcji v = k [A] - przy dużym stężeniu substratu szybkość reakcji zbliża się do jej maksymalnej wartości i stężenie substratu nie ma wpływu na szybkość reakcji v = k równoznaczne z całkowitym wysyceniem enzymu substratem. Na stałą Michaelisa wpływa: - rodzaj substratu - pH - temperatura - siła jonowa. Nie zależy od stężenia enzymu.

2. Co to jest energia aktywacji? Jakie ma znaczenie w katalizie enzymatycznej? Energia aktywacji – jest podawana w przeliczeniu na 1 mol substancji, wielkość bariery energetycznej, którą musi pokonać układ reagujących indywiduów chemicznych, aby doszło do reakcji chemicznej. Można ją wyznaczyć na podstawie równania Arrheniusa, opisującego zależność szybkości reakcji od temperatury. K = Ae–Ea/RT Ea = - RTln (

k ) A

A – stała danej reakcji

Im energia aktywacji mniejsza, tym szybkość większa. Katalizatory obniżają energię aktywacji przez tworzenie kompleksów przejściowych z substratami.

Działanie enzymów polega na obniżaniu energii aktywacji – enzymy ułatwiają tworzenie stanu przejściowego, przyspieszają reakcję. Połączenie substratu z enzymem stwarza nową drogę reakcji, w której energia stanu przejściowego jest niższa, niż w reakcji zachodzącej przy braku enzymu. Niższa energia aktywacji oznacza, że więcej cząsteczek posiada energię wymaganą do osiągnięcia stanu przejściowego. Istotą katalizy jest specyficzne wiązanie stanu przejściowego. 3. Omów czynniki wpływające na aktywność enzymów. a) temperatura: - wzrost temperatury o każde 10 stopni, podnosi szybkość reakcji enzymatycznej dwukrotnie - odbywa się to tylko do poziomu temperatury powodującej denaturację białka - denaturacja białka powoduje trwałą utratę zdolności katalitycznej - obniżanie temperatury obniża szybkość reakcji, ale nawet zamrożenie enzymu nie powoduje trwałego utracenia jego aktywności b) pH: - większość enzymów działa przy pH zbliżonym do środowiska obojętnego (ok. 7) - enzymy działające pozakomórkowo (w świetle przewodu pokarmowego) charakteryzują się znacznym zróżnicowaniem optymalnych warunków pH - pH wpływa na aktywność enzymów, bo są one białkami, a liczba dodatnich i ujemnych ładunków cząsteczki białka oraz ukształtowanie powierzchni zależą od kwasowości środowiska c) stężenie enzymu i substratu: - w stałej temperaturze, pH i ciśnieniu oraz przy nadmiarze substratu szybkość reakcji enzymatycznej jest wprost proporcjonalna do stężenia enzymu - kiedy temperatura, pH i stężenie enzymu są na stałym poziomie, to szybkość reakcji najpierw wzrasta, w miarę zwiększania się stężenia substratu do pewnej wartości, a następnie ustala się na jednym poziomie - do ustalenia równowagi dochodzi, gdy wszystkie cząsteczki enzymu są połączone z substratem d) inhibitory:

- w środowisku komórkowym występują różne substancje niskocząsteczkowe, które przyłączając się do enzymu powodują zmianę jego struktury przestrzennej - uniemożliwia to tworzenie się kompleksu E-S - czasami związek chemiczny, mający podobną budowę do substratu, konkuruje z nim o związanie się z centrum aktywnym - jeżeli inhibitor jest w dostatecznie dużym stężeniu to może całkowicie zablokować reakcję - zwiększenie stężenia substratu może spowodować wyparcie inhibitora e) aktywatory: - pod wpływem pewnych substancji może nastąpić taka zmiana konformacji enzymu, która jest korzystna dla procesu katalizy - aktywator przyłącza się do centrum aktywnego lub allosterycznego 4. Omów sposoby hamowania aktywności enzymów. a) inhibicja kompetycyjna:  inhibitor i substrat współzawodniczą o miejsce aktywne cząsteczki enzymu  związanie przez enzym cząsteczki inhibitora uniemożliwiia zatem związanie substratu  zwykle inhibitor kom petycyjny jest strukturalnie podobny do prawidłowego substratu

b) inhibicja akompetycyjna:  inhibitor nie może się wiązać do wolnego enzymu, a tylko do kompleksu E-S  w tej sytuacji zmniejszone jest stężenie kompleksu E-S, zwiększa się więc pozorne powinowactwo enzymu do substratu  powstały kompleks E i S jest katalitycznie nieaktywny, dlatego reakcja nie może być kontynuowana c) inhibicja niekompetycyjna:  inhibitory niekompetycyjne wiążą się do miejsca regulatorowego-centrum allosterycznego  nie konkurują z substratem  substrat może się przyłączyć  oba możliwe kompleksy są enzymatycznie nieaktywne

d) inhibicja mieszana:  przypomina inhibicję niekompetycyjną  dodatkowo występuje kompleks E i S mający znikomą aktywność 5. Wpływ stężenia enzymu i substratu na szybkość reakcji enzymatycznej.

Przy stałym stężeniu enzymu, szybkość reakcji w pewnych granicach zależy od stężenia substratu, na wykresie zależności szybkości reakcji od stężenia substratu: - przy niewielkim stężeniu substratu w stosunku do stężenia enzymu – zależność liniowa między stężeniem substratu a szybkością reakcji v = k [A] - przy dużym stężeniu substratu szybkość reakcji zbliża się do jej maksymalnej wartości i stężenie substratu nie ma wpływu na szybkość reakcji v = k równoznaczne z całkowitym wysyceniem enzymu substratem. Na stałą Michaelisa wpływa: - rodzaj substratu - pH - temperatura - siła jonowa. Nie zależy od stężenia enzymu. ĆWICZENIA: Ćw 37. p.4. – wyznaczanie stałej Michaelisa dla fosfatazy alkalicznej plazmy nasienia. Fosfataza alkaliczna(8,5-10) i kwaśna(4-5) katalizuje reakcje hydrolizy monoestrów ortofosforanowych, są to hydrolazy, mała swoistość, heterogenne. Formy izoenzymatyczne wydzielane z różnych tkanek różnią się optimum pH, ciężarem cząsteczkowym, ruchliwością elektroforetyczną, wrażliwością na aktywatory i inhibitory, budową części białkowej, zawartością kwasu sjalowego. W plazmie nasienia fosfataza kwaśna pełni funkcję enzymu defosforylującego fosfocholinę do wolnej choliny i ortofosforanu. Najwyższą aktywność fosfatazy alkalicznej wykazuje plazma nasienia knura i tryka, a fosfatazy kwaśnej – koguta i buhaja. U człowieka wysoka aktywność fosfatazy kwaśnej. Dominacja w nasieniu fosfatazy zasadowej. Przy zapaleniu jąder spadek aktywności fosfataz kwaśnych o ok.70%, a alkalicznych o ok. 30%. Aktywność fosfataz oznacza się za pomocą syntetycznego substratu: B-glicerofosforan, fenylofosforan, pnitrofenylofosforan, fosforan fenoloftaleiny. Aktywność enzymu mierzy się ilością uwolnionego fosforanu lub częścią organicznej estru. 4 pary probówek (kontrola + właściwa) + 0,5ml buforu + 0,5ml substratu -> łaźnia -> do właściwych enzym, do kontrolnych destylowaną + czas -> łaźnia 15min + NaOH -> odczytać absorbancję przy 410nm dla prób kontrolnych Ćw 22. p.3. – kinetyczne właściwości katalazy krwi – oksydoreduktaza nadtlenek wodoru erytrocyty, wątroba, nerki, zbliżony budową do peroksydaz, zawiera żelazo-protoporfirynową grupę prostetyczną, jego substratem jest nadtlenek wodoru. Katalaza rozkłada nadtlenek wodoru, który powstaje w komórkach na skutek procesów oksydoredukcyjnych. Oznaczanie optimum pH katalazy: optimum pH – ściśle określone pH środowiska, w którym enzym wykazuje największą aktywność, wynika to głównie ze składu aminokwasowego cząsteczki białka enzymu. Zmieniające się pH środowiska zmienia jonizację wolnych grup aminokwasowych i karboksylowych = następstwem zmiany w powinowactwie enzymu do substratu.

Rozcieńczyć krew wodą – hemoliza -> 6 erlenmeyerek roztwory buforowe (octan sodu + HCl, Na2HPO4 + NaH2PO4, boran sodu + HCl) do każdej po 2ml krwi i po 15sekundacg 2ml H2O2, odstawić potem dodać H2SO4, miareczkować KMnO4. Hamowanie aktywności katalazy: cyjanki są inhibitorami enzymów oksydoredukcyjnych, gdy enzymy zawierają w grupie prostetycznej jon żelaza trójwartościowego – katalaza, peroksydaza, oksydaza cytochromowa, jony cyjankowe reagujące z żelazem grupy prostetycznej uniemożliwiają wiązanie się substratu z tym enzymem. Bufor, w którym katalaza wykazała największą aktywność + KCN + H2O2....