Kromatografi Kolom PDF

Preview

Summary

LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA DAN ANALISIS PANGAN KROMATOGRAFI KOLOM NAMA : WAHYU ERWIN FIRMANSYAH NIM : 125100101111014 KELOMPOK : J3 KELAS :J ASISTEN : ISMI PROGRAM STUDI ILMU DAN TEKNOLOGI PANGAN JURUSAN TEKNOLOGI HASIL PERTANIAN FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN UNIVERSITAS BRAWIJAYA MALANG 2014 Wahyu E...

Description

Accelerat ing t he world's research.

Kromatografi Kolom Erwin Firmansyah

Related papers Laporan Ket rampilan Analisis Kimia.docx Lulut T Margirahayu Analisis Bahan Pangan (Proksimat Buah dan Sayur) t et y heryant i Tugas Makalah Fit okim Mut iara Dewant i

Download a PDF Pack of t he best relat ed papers 

LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA DAN ANALISIS PANGAN KROMATOGRAFI KOLOM

NAMA NIM KELOMPOK KELAS ASISTEN

: WAHYU ERWIN FIRMANSYAH : 125100101111014 : J3 :J : ISMI

PROGRAM STUDI ILMU DAN TEKNOLOGI PANGAN JURUSAN TEKNOLOGI HASIL PERTANIAN FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN UNIVERSITAS BRAWIJAYA MALANG 2014

Wahyu Erwin Firmansyah THP-FTP-UB-2014

BAB VIII KROMATOGRAFI KOLOM A. Pre-lab

1. Apa yang dimaksud kromatografi? Kromatografi adalah metode pemisahan dengan memanipulasi sifat fisik penyusun

campuran dimana komponen-komponen-komponen yang dipisahkan didistribusikan diantara dua fase, salah satu fase tersebut adalah suatu lapisan stasioner dengan

permukaan yang luas, yang lainnya sebagai fase gerak atau mobile. Sifat fisik yang

dimanipulasi yaitu partisi, adsorpsi, dan volatilisasi. Fase stasioner dalam kromatografi dapat berupa padatan maupun cairan, sedangkan fase gerak dapat berupa cairan maupun

gas. Molekul yang terlarut dalam fase gerak, akan melewati kolom yang merupakan fase

diam. Molekul yang memiliki ikatan yang kuat dengan fase diam akan cenderung bergerak lebih lambat dibanding molekul yang berikatan lemah (Sastrohamidjojo, 2004). 2. Jelaskan prinsip kromatografi adsorpsi? Prinsip kromatografi adsorpsi yaitu memisahkan komponen secara selektif

berdasarkan sifat fisik adsobrs dengan fase stationer berupa adsorben alumina yang

mengisi kolom dan fase mobile PE-aseton dengan perbandingan 10:1. Kecepatan pergerakan suatu komponen tergantung pada kemampuannya untuk tertahan atau terhambat oleh penyerap di dalam kolom (Sastrohamidjojo, 2004). 3. Apa fungsi alumina pada penentuan beta karoten? Fungsi alumina pada penentuan beta karoten yaitu sebagai adsorben polar (fase

diam) yang dapat mengadsorpsi solut yang bersifat polar dan untuk memisahkan senyawa

yang bersifat basa karena alumina ini bersifat basa. yaitu senyawa karotenoid selain beta

karoten yang akan diikat oleh alumina pada fase diam, dan betakaroten (non polar) akan larut bersama fase gerak (Noviyanti, 2010).

4. Jelaskan pengertian fase stasioner dan fase mobil! Fase stationer merupakan fase diam pada kromatografi untuk menahan komponen

campuran. Komponen yang mudah tertahan pada fase diam akan tertinggal. Senyawa tetap diam atau tidak berpindah dalam kromatografi yang berupa adsorben yang tidak

boleh larut dalam fase gerak. Selain itu, ukuran fase diam harus seragam, contohnya: alumunium, silica gel, arang (Gritter dkk, 2004).

1

Wahyu Erwin Firmansyah THP-FTP-UB-2014 Sedangkan fase mobil merupakan fase bergerak yang melarutkan zat komponen

campuran. Komponen yang mudah larut dalam fase gerak akan bergerak lebih cepat. Fase ini bisa berupa cairan, gas, atau cairan superkritis. Selain itu, fase ini dapat berupa

pelarut tunggal atau campuran beberapa pelarut dengan komposisi tertentu. Pelarut

merupakan pelarut polar maupun pelarut nonpolar. Fase mobil terdiri dari sampel yang dipisahkan dan solven yang menggerakkan sampel sepanjang kolom misal. Pada kolom

kromatografi misal, fase mobil bergerak sepanjang kolom dimana sampel berinteraksi dengan fase stationer dan dipisahkan (Gritter dkk, 2004).

5. Apa yang dipisahkan pada proses kromatografi adsorbsi pada penentuan kadar beta Karoten?

Senyawa atau zat yang dipisahkan pada proses kromatografi adsorbsi pada

penentuan kadar beta karoten yaitu pigmen beta karoten dan komponen lain yang menyusun senyawa tersebut. Pemisahan beta karoten berdasarkan polaritasnya. Beta

karoten bersifat non-polar, sehingga yang untuk memisahkan dari senyawa menggunakan pelarut heksana, karena heksana adalah pelarut non polar dan betakaroten terlarut didalamnya (Khopkar, 2008).

2

Wahyu Erwin Firmansyah THP-FTP-UB-2014 Tinjauan Pustaka 1. Kromatografi Kolom

Kromatografi Kolom merupakan Metode pemisahan yang di dasarkan pada

pemisahan daya adsorbsi suatu adsorben terhadap suatu senyawa, baik pengotornya maupun hasil isolasinya. Seberapa jauh komponen itu dapat diserap absorben tergantun

pada sifat fisika komponen tersebut. Prinsip kerja kromatografi kolom perbedaan daya serap dari masing-masing komponen, campuran yang akan diuji, dilarutkan dalam

sedikit pelarut lalu di masukan lewat puncak kolom dan dibiarkan mengalir kedalam zat menyerap. Senyawa yang lebih polar akan terserap lebih kuat sehingga turun lebih

lambat dari senyawa non polar terserap lebih lemah dan turun lebih cepat. Zat yang di serap dari larutan secara sempurna oleh bahan penyerap berupa pita sempit pada

kolom. Pelarut lebih lanjut / dengan tanpa tekanan udara masing-masing zat akan bergerak turun dengan kecepatan khusus sehingga terjadi pemisahan dalam kolom (Sastrohamidjojo, 2004). 2. Beta Karoten

Beta karoten merupakan pigmen atau zat kimia alami yang berwarna merah,

kuning, hingga jingga yang terdapat dalam buah-buahan dan sayuran. Beta karoten merupakan senyawa organik, secara kimiawi diklasifikasikan sebagai hidrokarbon dan

secara spesifik diklasifikasikan sebagai terpenoid. Beta karoten merupakan karotenoid, precursor vitamin A dan sebagai antioksidan. Beta karoten tidak larut dalam air tetapi larut dalam pelarut non polar. Beta karoten antara lain terdapat pada buah dan sayur seperti wortel, tomat, dll. Pigmen warna ini tergolong dalam karotenoid yang banyak memberikan manfaat. Manfaat beta karoten ini antara lain menjamin kesehatan mata,

memlihara kesehatan kulit, mempertahankan membran sel, berperan dalam sistem

kekebalan tubuh dan kesehatan tulang, serta membantu pembentukan sel darah merah

dan bekerjasama dengan vitamin C dalam menyembuhkan luka (Rachman & Histifarina, 2010).

3. Tinjauan Sampel a) Brokoli

Brokoli (Brasicca oleracea) merupakan tanaman sayuran sub tropik yang banyak

dibudidayakan di Eropa dan Asia. Brokoli merupakan tanaman yang termasuk dalam tanaman dwimusim yaitu pertumbuhan vegetatif terjadi pada fase pertama dan pertumbuhan generatif pada fase berikutnya. Brokoli mengandung air, protein, lemak

karbohidrat, serat, kalsium, zat besi, vitamin (A, C, E, tiamin, riboflavin, nikotinamid), beta karoten dan glutation (Kurniasih, 2011).

3

Wahyu Erwin Firmansyah THP-FTP-UB-2014 b) Labu Kuning

Labu kuning (Cucurbita moschata) merupakan sayuran yang berwarna kuning yang

banyak mengandung beta karoten dimana beta karoten ini berperan sebagai antioksidan

disamping komponen nutrisi lain seperti karbbohidrat, protein, lemak, serat dan mineral. Di dalam tubuh beta karoten akan diubah menjadi vitamin A yang bermanfaat bagi

kesehatan tubuh untuk pertumbuhan, pemeliharaan jaringan tubuh dan penglihatan, reproduksi, perkembangan janin serta untuk mengurangi resiko timbulnya penyakit

kanker dan hati. Kadar beta karoten pada labu kuning sebesar 1187,23 µg/g (Usmiati dkk, 2009). c) Wortel

Wortel (Daucus carrota) merupakan salah satu jenis sayuran yang bernilai gizi

cukup tinggi, terutama kandungan senyawa karoten yaitu alfa dan beta karoten. Kedua

senyawa ini merupakan sumber provitamin A dan prekursor vitamin A. Dalam setiap 100

gram wortel mengandung 2813 µg vitamin A. Adanya kandungan beta karoten yang cukup tinggi menjadikan wortel mempunyai prospek yang baik sebagai sumber provitamin A untuk mencegah penyakit kekurangan vitamin A yang masih banyak diderita oleh sebagian masyarakat Indonesia (Rachman & Histifarina, 2010). d) Jagung Manis

Jagung manis (Zea mays) merupakan sumber sayuran yang kaya vitamin A, B, E dan

banyak mineral. Jagung manis merupakan salah satu komoditas pertanian yang disukai oleh masyarakat karena rasanya yang enak, mengandung karbohidrat, protein, rendah

lemak, dan vitamin yang tinggi. Jagung manis memiliki kadar vitamun A yang lebih tinggi dibanding dengan jagung biasa. Dalam 100 gr bahan kandungan vitamin A yaitu sebesar 400 SI (Iskandar, 2007).

4

Wahyu Erwin Firmansyah THP-FTP-UB-2014 B. Diagram Alir Penentuan Kadar Kadar Beta Karoten Dengan Kromatografi Kolom Adsorbsi

1. Ekstraksi Sampel

Sampel dihaluskan ditimbang 3 g dimasukkan dalam erlenmeyer

20 ml petroleum eter-aseton (1:1)

erlenmeyer ditutup alumunium foil residu dalam erlenmeyer

diaduk dengan shieve shaker selama 15 menit

diulangi proses ekstraksi sebanyak 3 kali

disaring

filtrat diambil

filtrat dimasukkan dalam erlenmeyer

100 ml petroleum eter-aseton (1:1)

diencerkan dengan cara dikocok menggunakan shieve shaker 15 menit filtrat diambil 25 ml dimasukkan dalam corong pemisah

25 ml aquades

dikocok

dibiarkan hingga terjadi pemisahan lapisan bawah (air-aseton)

fase eter dalam corong pemisah dikocok

25 ml aquades

dialirkan keluar dari corong pemisah dibuang

dibiarkan hingga terjadi pemisahan Fase Eter

lapisan bawah (air-aseton) dialirkan keluar dari corong pemisah dibuang

5

Wahyu Erwin Firmansyah THP-FTP-UB-2014 2. Penetapan Kadar Beta Karoten Fase Eter dimasukkan dalam gelas beker 1 gram Na2SO4 tiap 20 ml fase eter diaduk filtrat dimasukkan dalam kolom kromatografi larutan petroleum eter 10:1 beta karoten ditampung dalam labu ukur 25 ml larutan petroleum eter 10:1 hingga tanda batas digojog diukur absorbansi dengan panjang gelombang 450 nm dihitung kadar beta karoten Hasil

6

Wahyu Erwin Firmansyah THP-FTP-UB-2014 C. Hasil dan Pembahasan Persamaan regresi kurva standar : No

Konsentrasi

Absorbansi

1

0

0,009

2

0,2

0,023

3

0,4

0,041

4

0,6

0,084

5

0,8

0,100

6

1

0,312

Kurva Standar

0.350

Kurva Standar y = 0.255x - 0.033 R² = 0.728

0.300 Absorbansi

0.250 0.200 0.150

Series1

0.100

Linear (Series1)

0.050 0.000

-0.0500.000 0.200 0.400 0.600 0.800 1.000 1.200 -0.100

Konsentrasi

y = 0,255x 0,033

No

Jenis Sampel

Berat Sampel

Absorbansi

V masuk kolom

V keluar kolom

Kadar ß-karoten mg/100g

1.

Paprika Kuning

3,0134 gr

0,180

8 ml

25 ml

86,59

2.

Wortel

3,0352 gr

1,172

9 ml

25 ml

432,43

3.

Brokoli

3,0216 gr

0,129

9 ml

25 ml

58,42

4.

Jagung Manis

3,0093 gr

0,103

10 ml

25 ml

44.28

7

Wahyu Erwin Firmansyah THP-FTP-UB-2014 Perhitungan kadar beta karoten dari sampel yang dianalisis : y = 0,255x 0,033 Kadar ß-karoten =

(

FP =

)

1. Paprika Kuning

y = 0,255x 0,033

0,180 = 0,255x 0,033 0,255x = 0,213

x = 0,213/0,255 = 0,835 FP =

=

= 3,125

Kadar ß-karoten = Kadar ß-karoten =

,

,

,

(

)

= 86,59 mg/100g

2. Wortel

y = 0,255x 0,033 1,172 = 0,255x 0,033 0,255x = 1,205

x = 1,205/0,255 = 4,725 FP =

=

= 2,778

Kadar ß-karoten = Kadar ß-karoten =

( ,

,

,

)

= 432,43 mg/100g

3. Brokoli

y = 0,255x 0,033

0,129 = 0,255x 0,033 0,255x = 0,162

x = 0,162/0,255 = 0,635 FP =

=

= 2,778

Kadar ß-karoten = Kadar ß-karoten =

,

,

,

(

)

= 58,42 mg/100g

8

Wahyu Erwin Firmansyah THP-FTP-UB-2014 4. Jagung Manis

y = 0,255x 0,033

0,103 = 0,255x 0,033 0,255x = 0,136

x = 0,136/0,255 = 0,533 FP =

=

= 2,5

Kadar ß-karoten = Kadar ß-karoten =

,

,

,

(

)

= 44,28 mg/100g

Pertanyaan 1. Apa yang menjadi fase stasioner dan fase mobil pada analisis beta karoten dengan kromatografi kolom?

Fase stasioner pada analisis beta karoten dengan kromatografi kolom yaitu alumina dimana alumina sebagai fase diam berfungsi untuk mengikat senyawa yang polar

seperti aseton dan air. Alumina juga akan memberikan gaya adsorbsi pada fraksi

campuran sehingga fraksi-fraksi tersebut dapat memisah berdasarkan tingkat kepolarannya Sedangkan fase mobil pada analisis beta karoten dengan kromatografi

kolom yaitu PE-aseton (10:1) dan (1:1) dimana PE-aseton (10:1) berfungsi sebagai fase bergerak yang mengelusi senyawa nonpolar dan mengekstrak karoten dalam sampel.

Secara bersamaan komponen campuran tersebut akan mengalami gaya adsorbsi dan partisi sehingga dapat terpisah.

2. Komponen apa yang terelusi pada analisis beta karoten dengan kromatografi kolom?

Komponen yang terelusi pada analisis beta karoten dengan kromatografi kolom yaitu komponen beta karoten dalam sampel. Komponen beta karoten dalam sampel yang bersifat nonpolar akat terikat atau terelusi dengan fase mobil atau fase bergerak yaitu

PE-aseton (10:1). Beta karoten mengalami elusi atau gaya partisi paling besar karena bersifat paling nonpolar dari senyawa lainnya atau tingkat kepolarannya sama dengan

fase mobil sehingga ketika terjadi pemisahan, beta karoten akan berada paling bawah dan akan keluar terlebih dahulu dari kolom kromatografi. 3. Komponen apa yang teradsorbsi kuat pada adsorben?

Komponen yang teradsobsi kuat pada adsorben yaitu komponen yang bersifat polar dalam sampel. Komponen polar tersebut akan terikat kuat pada adsorben karena

mempunyai afinitas yang lebih besar dari komponen lainnya sehingga secara selektif akan tertahan pada adsorben.

9

Wahyu Erwin Firmansyah THP-FTP-UB-2014 4. Apakah analisis tersebut dapat memisahkan beta karoten dengan karotenoid lain seperti alfa dan gama karoten?

Tidak bisa, pada analisis tersebut tidak bisa untuk memisahkan beta karoten dengan karotenoid lain seperti alfa dan gama karoten. Hal tersebut disebabkan karena metode kromatografi kolom hanya dapat memisahkan total karotenoid dalam sampel

dengan prinsip memisahkan komponen secara selektif berdasarkan sifat fisik adsobs

dengan fase stationer, sehingga tidak dapat memisahkan jenis karotenoid secara spesifik. Metode yang paling sesuai untuk memisahkan beta karoten dengan karotenoid lain seperti alfa dan gamma karoten yaitu dengan menggunakan HPLC. Karotenoid yang dipisahkan dengan HPLC akan terpisah secara spesifik.

5. Apa fungsi pengukuran kadar beta karoten dalam eluat dengan spektrofotometer?

Fungsi pengukuran kadar beta karoten dalam eluat dengan spektrofotometer yaitu untuk mengukur absorbansi eluat beta karoten berdasarkan intensitas warnanya

dengan panjang gelombang 450 nm. Dengan diketahuinya absorbansi maka dapat ditentukan konsentrasi beta karoten dalam sampel menggunakan kurva standar beta karoten.

6. Apa fungsi ekstraksi dengan petroleum eter-aseton?

Fungsi ekstraksi dengan PE-aseton yaitu untuk mengekstrak beta karoten dalam

sampel. Beta karoten yang bersifat nonpolar akan larut dalam PE-aseton yang memiliki kepolaran yang sama (nonpolar) sehingga dapat dipisahkan dari komponen senyawa yang lain.

7. Fraksi apa saja yang terekstrak pada proses ekstraksi tersebut?

Fraksi yang terekstak pada proses ekstraksi yaitu fraksi yang bersifat polar dan

nonpolar. Fraksi polar terekstraksi oleh adanya aseton, sedangkan fraksi nonpolar (beta karoten) terekstraksi oleh PE-aseton.

8. Apa fungsi penambahan akuades pada ekstrak petroleum eter-aseton?

Fungsi penambahan akuades pada ekstrak petroleum eter-aseton yaitu untuk mengikat fase polar. Dengan penambahan aquades ada pemisahan antara fase polar dan nonpolar. Fase polar yang terikat dengan aquades selanjutnya dikeluarkan dari kolom agar tidak mengganggu proses ekstraksi beta karoten.

9. Fraksi apa yang larut pada aseton-air dan petroleum eter?

Fraksi yang larut pada aseton-air yaitu fraksi polar, sedangkan fraksi yang larut dalam PE yaitu fraksi nonpolar dimana pada percobaan ini fraksi yang bersifat nonpolar yaitu beta karoten.

10

Wahyu Erwin Firmansyah THP-FTP-UB-2014 PEMBAHASAN 1. Prinsip & Rumus Kromatografi Kolom

Prinsip kromatografi yang digunakan yaitu memisahkan komponen secara selektif

berdasarkan sifat fisik adsobs dengan fase stationer berupa adsorben alumina yang

mengisi kolom dan fase mobil PE-aseton (10:1) untuk mengelusi atau mengikat senyawa nonpolar.

Rumus yang digunakan dalam kromatografi yaitu: y = ax +b

persamaan kurva standar

Kadar ß-karoten =

(

)

FP = Keterangan:

Y = absorbansi

X = konsentrasi

Kadar ß-karoten (mg/100g) FP = Faktor pengenceran Berat sampel (gr)

Vol keluar kolom (ml)

Vol masuk kolom (ml) 2. Analisis Prosedur Kromatografi Kolom Pada percobaan kromatografi kolom, alat yang digunakan antara lain: mortar,

spatula, timbangan analitik, pipet ukur, bulb, erlenmeyer, alumunium foil, shieve skaker,

kertas saring, corong kaca, corong pemisah, kolom kromatografi, statif, labu ukur,

beaker glass, spektrofotometer, dan kuvet. Bahan yang digunakan antara lain: wortel, jagung manis, PE-aseton (10:1) dan (1:1), kapas, Na2SO4, alumina, dan aquades. Ada tiga

tahap utama dalam kromatografi kolom yaitu pembuatan kolom, proses ekstraksi sampai fase eter, dan penentuan kadar beta karoten sampel. a) Pembuatan Kolom + Gambar

Pada pembuatan kolom terlebih dahulu dilakukan persiapan alat dan bahan.

Sebelum diisi dipastikan terlebih dahulu bahwa kolom kromatografi yang digunakan

dalam keadaan bersih. Bahan pertama yang dimasukkan yaitu kapas. Kapas digulung

atau dipilir kecil supaya lebih mudah dimasukkan sampai ke dasar kolom. Untuk mempermudah memasukkan kapas maka digunakan spatula. Kapas yang dimasukkan dalam kolom kromatografi setinggi 1,5 cm. Penggunaan kapas tersebut berfungsi

membantu penyerapan senyawa yang akan dipisahkan, selain itu kapas berguna untuk

11

Wahyu Erwin Firmansyah THP-FTP-UB-2014 menjernihkan ekstrak beta karoten dari pengotor agar tidak terikut dalam ekstrak

sehingga nantinya akan terpisah dalam labu penampung. Kemudian ditambahkan

alu...