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Neyshalee Ortiz Fontanet Sección: QUIM4016-001 Grupo #7 Fecha de realización: 4/feb/2010 Fecha de entrega: 18/feb/2020

Cromatografía Líquida de Alta Presión (HPLC) Determinación de cafeína en bebidas carbonatadas empleando cromatografía líquida de alta eficiencia (LC1).

Introducción: Este laboratorio consistió en la determinación de la concentración de cafeína presente en una bebida carbonatada (Coca Cola Clásica 16 oz de 473 ml) mediante el método de Cromatografía Líquida de Alta Presión (HPLC). Esta técnica se basa en la separación de los componentes de una mezcla utilizando las sustancias analizadas y la columna cromatográfica. Nuestra muestra se mezcló con la fase móvil que fue de 35% metanol y 65 % de agua desgasificada para luego preparar 5 soluciones con diferentes concentraciones para finalmente ser inyectadas en el cromatógrafo.

Teoría: a) Técnica de Cromatografía Líquida: Es una técnica que es utilizada para la separación de los componentes de una mezcla. Consiste en dos fases: la fase estacionaria y la fase móvil. Los componentes de la muestra se distribuyen entre las dos fases de acuerdo con sus solubilidades o afinidades relativas hacia ellas. En la cromatografía líquida la fase móvil fluye a través de la columna que contiene la fase fija. Esta técnica se lleva a cabo en una columna de vidrio, lo cual tiene dentro la fase fija. Luego de inyectar la muestra en la parte superior, se hace fluir la fase móvil con altas presiones. b) Aspectos cualitativos y cuantitativos de HPLC: El análisis cualitativo se puede utilizar en la cromatografía como lo es el tiempo de retención. El tiempo de retención es el tiempo que transcurre luego de la inyección de la muestra hasta que alcanza la concentración máxima del analito en el detector. El análisis cuantitativo se basa en el área del pico que pertenece al estándar del componente de interés en comparación con los estándares de la sustancia de concentración conocida. Entre ellos se formará una relación lineal. c) Detectores usados en HPLC:

I.

Detectores de absorción UV-visible: El flujo del líquido que sale de la columna pasa a través de una pequeña celda para minimizar el ensanchamiento de banda. La medida de absorbancia del líquido que la atraviesa en función de tiempo constituye un cromatograma

II.

Detectores de absorción ultravioleta con filtros: Es el detector de UV más sencillo y utiliza una lámpara de mercurio como fuente y una serie de filtros para aislar la intensa línea, con la que mide absorbancia.

III.

Detectores de absorción con capacidad de barrido: permite realizar el análisis seleccionado en una o varias longitudes de onda en la región de interés.

IV.

Detectores de absorbancia en el infrarrojo: Se emplea en aquellos analitos que absorben radiación infrarroja, por lo que se debe observar el disolvente utilizado, ya que puede absorber estas radiaciones también.

V.

Detectores de fluorescencia: emplean una fuente de excitación de mercurio y uno o más filtros para aislar la radiación fluorescente.

VI.

Detector de índice de refracción: consta en una cubeta con dos compartimientos separados por una placa de vidrio, por donde solamente pasa la fase móvil, y por el otro pasa el eluato que abandona la columna y que contiene la muestra. Sobre la cubeta se irradia un haz de luz que se desvía cuando la muestra aparece en el líquido eluido de la columna.

VII.

Detectores de la dispersión de la luz tras evaporación: La dispersión se produce por la interacción de la radiación electromagnética con la materia. El eluato que abandona la columna se nebuliza mediante un flujo de aire y se vaporiza la fase móvil, quedando únicamente unas gotas de soluto sin evaporar. La nube de partículas de analito pasa a través de un haz de láser y la dispersión producida es detectada por un fotodiodo de silicio.

VIII. Detectores electroquímicos: Este tipo de detectores responden a analitos susceptibles de reducirse u oxidarse. IX.

Detectores espectrométricos de masas: Ayudan a identificar especies a medida que salen en la columna cromatográfica.

d) Funcionamiento del inyector: La función del inyector es introducir la muestra en la columna a la fase móvil bajo alta presión. e) Cromatografía de partición: la fase estacionaria es un líquido soportado en un sólido inerte. La fase móvil puede ser un líquido o un gas. La cromatografía en papel es un tipo de cromatografía de partición en la cual la fase estacionaria es una capa de agua adsorbida en una hoja de papel. f) Separaciones isocráticas y con gradiente: Se denomina isocrática cuando se utiliza el mismo solvente durante toda la separación. Se realiza con un gradiente de composición del solvente a lo largo de la cromatografía para mejorar la eficiencia y acortar la duración del proceso. Instrumento utilizado: a) Bloques del instrumento

b) Descripción Programa Fase móvil Tipo de ecuación empleada Flujo de fase móvil Largo de onda del detector Volumen de inyección Temperatura Columna

Peak Simple Version 4.53 ( 6 channel) Metanol / Agua (35% 65%) Isocrática 1.00 mL/ min 254 nm 20 μ L 73 ℃ Phenomenex 00B-4022-E0 Hypersil BDS 5U C18 130ª 50X 4.60 MM 5 Micron 477532-4

c) Generación de la Señal Analítica: La señal se genera luego de introducir la muestra en el inyector. La muestra pasa a la columna y se separan los componentes a diferentes tiempos de retención, luego el detector ultravioleta visible recibe estas señales y lo proyecta en forma de cromatograma en una computadora con el uso de un programa en especifico. Datos: a) Desconocido Muestra Cantidad Contenido de cafeína

Coca Cola Clásica 473 mL (16 oz) 45 mg

b) Estándar Estándar Peso formula Pureza Cantidad pesada

Cafeína 194.19 g/mol 99 ± 1% 0.1007 ± 0.0002 g

c) Reactivo Reactivo Peso Formula Pureza Cantidad

Metanol 32.04 g/mol 99 ± 1% 175 mL

d) Cromatogramas: Se encuentran al final del informe.

Cómputos: a) Concentración de Cafeína:

(0.1007 ± 0.0001 g)

g puro 1000 mg ( 10099±g impuro )( 1 g ) =0.9969 mg / mL

100.00 ± 0.08 mL

√(

i=

)(

0.0001 2 0.08 + 0.1007 100.00

)

2

Concentración de cafeína:

x 0.9969 = 0.0001

0.9969

± 0.0001mg / mL

b) Concentración de cafeína en una de las disoluciones:

Dilución 2 =

√(

i=

( 0.9969mg / ml ) (1.00 ml) =0.03987 mg / ml 25 ml

)(

) ( )

0.0001 2 0.006 2 0.03 + + 0.9969 1.000 25

2

x 0.03987 = 0.0002

Concentración de dilución = 0.03987 ± 0.002mg / ml Estándar 1 2 3 4 5

Concentración de Cafeína Estándar Concentración de Cafeína Estándar (mg/mL) 0.0399 ± 0.0002 mg/mL 0.080 ± 0.007 mg/mL 0.1196 ± 0.0004 mg/mL 0.159 ± 0.002 mg/mL 0.1999 ± 0.0003 mg/mL

c) Área promedio de una de las diluciones

1 eradilución=

S=

S=

√

√

620.179+ 625.055 + 612.1955 =619.1955 3

± S

∑ (Xi−X )2 N −1

∑ (620.179 −61955 )2 +( 625.055− 619.1955 )2+( 612.3525− 619.1955)2

= 6.4

3−1

Área promedio = 619.1955

± 6.4

d) Resumen de datos

Dil.1 Dil.2 Dil.3 Dil.4 Dil.5

Inj.1 Inj.2 Inj.3 620.179 625.055 612.3525 986.243 1010.136 1097.0495 1433.719 1435.737 1415.9955 2059.672 1758.699 1903.003 2370.717 2281.0275 2227.974

Prom. 619.1955 1031.14283 1428.48383 1907.12467 2293.2395

Stvd 6.40810664 58.313681 10.862179 150.528827 72.1508193

Conc. (mg/mL) 0 0.03987 0.07975 0.1196 0.1595

e) Análisis de Mínimos Cuadrados

X(conc) 0 0.03987 0.07975 0.1196 0.1595

Y(area) XY X^2 Y^2 Ycor 619.1955 0 0 383403.067 611.048073 1031.14283 41.1116646 0.00158962 1063255.54 1033.42148 1428.48383 113.921585 0.00636006 2040566.05 1455.90083 1907.12467 228.092111 0.01430416 3637124.51 1878.06236 2293.2395 365.7717 0.02544025 5258947.4 2300.75358

Sum. Prom.

N=

0.39872 7279.18633 748.897061 0.04769409 12383296.6 0.079744 1455.83727

5

M=

3

Sxx=

0.015898562

Syy=

1785985.842

Sxy=

168.4256262

Sy(Sr)=

23.97459645

f) Gráfica:

Xdesc =

y −b m

Xdesc =

0−611.04807 = -0.05768 10593.765

Concentración con incertidumbre: 0.057 ± 0.003

h) Concentración de cafeína en desconocido (Cafeína en el desc.)(Vol .total diluc mL) (Vol . de la alicuota de cafeína mL)

Cafeína en desc.=

Cafeína en desc. =

√(

i=

(0.057 mg/mL )(25.0 ± 0.03 mL ) =0.095 mg / mL (15.00 ± 0.03 mL)

)(

)(

)

0.003 2 0.03 2 0.03 + + 0.057 15.00 25.00

Cafeína en desc. = 0.095

2

= 0.005

± 0.005 mg/ mL

0.095mg ¿∗100 mL=9.5 mg 1 mL

Cafeína en 100 mL = (

Análisis de Resultados y conclusiones:

a) Resumen de Resultados Concentración de Cafeína en solución

0.9969 mg / mL

± 0.002

patrón Área promedio de las diluciones 1 2 3 4 5

619.1955 1031.1428 1428.4838 1907.1247 2293.2395

Concentraciones Estándar de Cafeína en las Diluciones 1 0

2 3 4 5

0.03987 0.07975 0.1196 0.1595

Concentración de Cafeína en el

0.95

± 0.005 mg/ mL

Desconocido b) Análisis de Resultados RSD= %Error=

0.005 ∗100=5 % 0.095

|0.095 −0.057| 0.095

x100 = 40%

La precisión en este experimento fue de 5%, este porciento de desviación estándar se pasa del valor mínimo, así que podemos concluir que no es muy buena. Se determinó que no hay buena exactitud ya que el porciento de error relativo es muy alto. Posibles fuentes de error fueron la limpieza de los instrumentos ya que se pudieron haber contaminado.

c) Adición Estándar La adición estándar consiste en tomar un volumen fijo de la muestra, la cual le agregamos un estándar concentrado para poder añadir un volumen pequeño y evitar el efecto de dilución. Con este método se obtiene una recta donde el punto negativo en x, nos da la concentración del analito en las diluciones, cuando y=0. Este método nos ayuda a conocer la cantidad de cafeína en la muestra. También nos ayuda a eliminar las interferencias de matriz cuando hay muchas, y así nos deja resultados más claros. Referencias: 1. D.A. Skoog y J. J. Leary, Principles of Instrumental Analysis, Quinta Edición, Capítulo 1 pp15-18, Capítulo 28 pp 725-750, Philadelphia: Saunders College Publishing, 1997.

2. Adición Estándar: http://worlderlenmeyer.blogspot.com/2012/10/metodo-deadiciones-estandar-y.html...