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Capítulo 6

Cómo leen las células el genoma: del DNA a la proteína DEL DNA AL RNA DEFINICIONES 6–1

Factor general de transcripción

6–2

snRNA (RNA nuclear pequeño)

6–3

Promotor

6–4

Exosoma

6–5

rRNA (RNA ribosómico)

6–6

mRNA (RNA mensajero)

6–7

Maduración del RNA por corte y empalme o ayuste del RNA

6–8

Terminador

6–9

Transmaduración (transayuste)

6–10

Exón

6–11

Complejo de poro nuclear

VERDADERO/FALSO 6–12

Verdadero. Los errores en la replicación del DNA pueden afectar a generaciones futuras de células, mientras que los errores en la transcripción no tienen consecuencias genéticas. Los errores en la transcripción generan alteraciones en una pequeña fracción de los RNA, cuyas funciones son posteriormente evaluadas por los mecanismos de control de calidad. La característica esencial es que los errores en la replicación del DNA cambian el gen y, por lo tanto, afectan a todas las copias del RNA (y de proteínas) que se sinteticen en la célula y en toda su progenie de células. Por el contrario, los errores en la transcripción se limitan a una pequeña cantidad de RNA defectuosos (y de proteínas) y no se transmiten a las células hijas. Estas consideraciones se reflejan en las tasas de errores intrínsecos de las RNA y DNA polimerasas: las RNA polimerasas típicamente cometen una equivocación cada 104 nucleótidos copiados, mientras que las DNA polimerasas cometen cerca de una equivocación por cada 107 nucleótidos. Esta diferencia tan significativa en las tasas de error sugiere que la selección natural ha sido más estricta contra los errores en la replicación que contra los errores en la transcripción.

6–13

Falso. La subunidad σ se asocia con el núcleo de la enzima RNA polimerasa bacteriana para formar la holoenzima RNA polimerasa únicamente durante la fase de iniciación de la síntesis de RNA. La subunidad σ ayuda al núcleo de la enzima a unirse al promotor y se mantiene asociada con el núcleo de la enzima hasta que la síntesis del RNA se ha iniciado adecuadamente, disociándose a continuación.

6 En este capítulo DEL DNA AL RNA

R121

DEL RNA A LA PROTEÍNA

R133

EL MUNDO DE RNA R147 Y EL ORIGEN DE LA VIDA

R122

Capítulo 6: Cómo leen las células el genoma: del DNA a la proteína

6–14

Verdadero. En su extremo 3′ cada mRNA eucariota tiene una cola de nucleótidos de adenina, el último de los cuales tiene una ribosa terminal con un grupo 3′-OH libre. En su extremo 5′ cada mRNA lleva una 7-metilguanosina que está unida 5′ a 5′ con el primer nucleótido del mRNA. Esta unión deja libre un grupo 3′-OH en la ribosa del nucleótido de la caperuza.

6–15

Falso. A pesar de que las secuencias intrónicas son en su mayoría prescindibles, deben ser eliminadas de modo preciso. Un error incluso de un solo nucleótido durante su eliminación cambiaría la pauta de lectura en la molécula de mRNA maduro y produciría una proteína aberrante.

6–16

Falso. Los extremos 3′ de la mayoría de los transcritos de pre-mRNA producidos por la RNA polimerasa II vienen definidos no por el punto de finalización de la transcripción, sino por la escisión de la cadena de RNA 10-30 nucleótidos después de la secuencia AAUAAA y unos 30 nucleótidos antes de una secuencia rica en GU o U.

PROBLEMAS PARA PENSAR 6–17

La mejor respuesta la dio el propio Francis Crick, quien acuñó en 1957 los términos “la hipótesis de la secuencia”, que propone que la información genética viene codificada por la secuencia de bases del DNA, y el “dogma central”, según el cual declara que el DNA fabrica el RNA y éste fabrica la proteína. “Llamé a esa idea el dogma central, por dos motivos, creo. Había ya usado la palabra obvia hipótesis en la hipótesis de la secuencia, y además quería sugerir que esta nueva suposición era más central y más poderosa. Quise remarcar que su naturaleza especulativa fuera enfatizada por sus nombres. Tal como sucedieron las cosas, la utilización de la palabra dogma causó casi más problemas de los que merecía. Varios años más tarde, Jacques Monod me indicó que parecía que yo no entendía el uso correcto de la palabra dogma, que es una creencia de la que no se puede dudar. Lo comprendí de un modo vago pero dado que pensaba que todas las creencias religiosas carecían de fundamentos serios, utilicé la palabra en el modo que yo pensaba en ella, no como la mayor parte del resto del mundo hace, y simplemente la apliqué a una gran hipótesis que, aunque plausible, tenía poca base experimental directa.” Referencia: Crick F (1988) What Mad Pursuit: A Personal View of Scientific Discovery, p 109. New York: Basic Books, Inc.

6–18

En realidad, las RNA polimerasas no se mueven en absoluto porque han sido fijadas y cubiertas de metal para preparar la muestra para su observación al microscopio electrónico. Antes de ser fijadas, se movían de izquierda a derecha, como indica la longitud gradual de los transcritos de RNA. Los transcritos de RNA son más cortos que el DNA que los codifica porque empiezan a encogerse (adquieren una estructura tridimensional) tan pronto como son sintetizados, mientras que el DNA es una doble hélice extendida.

6–19

A con 7, B con 4, C con 2, D con 5, E con 8, F con 3, G con 1 y H con 6.

6–20

Si la polimerasa transcribe la secuencia de izquierda a derecha, utilizará la cadena inferior como molde para generar la secuencia 5′-GUAACGGAUG (la secuencia de RNA correspondiente a la cadena superior de DNA). Si la polimerasa se mueve de derecha a izquierda, utilizará la cadena superior como molde para generar la secuencia 5′-CAUCCGUUAC (la secuencia de RNA correspondiente a la cadena de DNA inferior, escrita 5′→ 3′).

6–21

Los factores generales de transcripción desempeñan diversas funciones para estimular la transcripción por parte de la RNA polimerasa II. Ayudan a situar correctamente la RNA polimerasa en el promotor, ayudan a separar las dos cadenas de DNA para permitir que se inicie la transcripción y liberan la RNA polimerasa del promotor una vez que la transcripción ha comenzado. Son denominados “generales” porque se unen a todos los promotores utilizados por la RNA polimerasa II; se identifican con nombres que empiezan con TFII (factor de transcripción de la RNA

R123

DEL DNA AL RNA (A)

(B)

Figura 6–49 Rotación del dúplex debido al movimiento respecto a la RNA polimerasa (Respuesta 6–23). (A) Sentido de la rotación de la cuenta magnética. (B) Sentido de la rotación del DNA dúplex.

imán

bolita magnética

DNA RNA

RNA polimerasa

RNA

portaobjetos de vidrio

polimerasa II). Denominarlos factores “generales” de transcripción también sirve para distinguirlos de otras proteínas reguladoras de genes más especializadas que aumentan la transcripción en determinados promotores en ciertos tipos celulares. 6–22

La RNA polimerasa tiene que haberse desplazado de derecha a izquierda en la Figura 6–2. Si la RNA polimerasa no rotara alrededor del patrón mientras va avanzando, enrollaría el DNA por delante de ella, causando superenrollamientos positivos, y desenrollaría el DNA detrás de ella, causando superenrollamientos negativos. Si la RNA polimerasa fuera libre de rotar alrededor del patrón a medida que se desplaza a lo largo del DNA, no enrollaría o desenrollaría el DNA y no se generarían superenrollamientos. Referencia: Liu LF & Wang JC (1987) Supercoiling of the DNA template during transcription. Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A. 84, 7024-7027.

6–23

La bolita giraría en el sentido de las agujas del reloj desde la perspectiva del imán, como se muestra en la Figura 6–49A. Como se muestra en la Figura 6–49B, el movimiento de la hélice respecto a una RNA polimerasa fija causa la rotación de la hélice. Referencia: Harada Y, Ohara O, Takatsuki A, Itoh H, Shimamoto N & Kinosita K (2001) Direct observation of DNA rotation during transcription by Escherichia coli RNA polymerase. Nature 409, 113-115.

6–24

A partir de electromicrografías como las que se muestran en la Figura 6–1, parece claro que el RNA no se enrolla en torno al DNA, sino que va siendo estirado por detrás de la RNA polimerasa. Por lo tanto, la RNA polimerasa no parece revolverse alrededor del DNA mientras se desplaza. Otra evidencia, consecuente con esto, sugiere que la RNA polimerasa induce de hecho un superenrollamiento positivo por delante de ella y un superenrollamiento negativo detrás. Pero el nivel de tensión de superenrollamiento no es tan alto como se esperaría si el movimiento continuado de la RNA polimerasa generase niveles aún más altos de enrollamiento. Estas observaciones sugieren que la tensión de superenrollamiento es aliviada por la acción de las topoisomerasas de la célula, de manera que el superenrollamiento alrededor de la RNA polimerasa se mantiene en niveles óptimos.

6–25

La fosforilación del CTD es el suceso que permite la liberación de la RNA polimerasa de las otras proteínas presentes en el punto de inicio de la transcripción. La fosforilación también permite la asociación de un nuevo conjunto de proteínas que participan en el procesamiento del transcrito de RNA naciente. Entre estas proteínas se encuentran algunos de los componentes necesarios para la formación de la caperuza, la maduración y la poliadenilación.

6–26

Las colas aparecen porque los extremos del mRNA no son complementarios a los extremos del fragmento de restricción. Por lo tanto, una de las colas de cadena sencilla en cada extremo es DNA procedente del fragmento de restricción. Una cola de cadena sencilla en cada uno de los extremos corresponde al extremo 5′ del mRNA, que debe venir de algún exón situado a 5′ que no está presente en el fragmento de restricción. La cola de cadena sencilla del otro extremo corresponde al extremo 3′

R124

Capítulo 6: Cómo leen las células el genoma: del DNA a la proteína (A) NORMAL

(B) MUTANTE la mutación inactiva el sitio de maduración de 3’

173 pb

exón 1

exón 3

exón 2

exón 2

exón 1

gen

TRANSCRIPCIÓN

caperuza

AAA pre-mRNA

AAA mRNA TRADUCCIÓN

proteína normal

gen

TRANSCRIPCIÓN

caperuza

AAA pre-mRNA

MADURACIÓN caperuza

exón 3

MADURACIÓN caperuza

AAA mRNA TRADUCCIÓN

proteína mutante

del mRNA, que debe proceder de algún exón a 3′ que no está presente en el fragmento de restricción o simplemente la propia cola de poli-A. Sin información adicional, no puede identificar qué cadena sencilla procede de cada fuente. Referencia: Berget SM, Berk AJ, Harrison T & Sharp PA (1977) Spliced segments at the 5′ termini of adenovirus-2 late mRNA: a role for heterogeneous nuclear RNA in mammalian cells. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 42, 523-529. 6–27 A. El cambio de un solo nucleótido en un gen puede provocar la eliminación de una secuencia interna del mRNA si altera la maduración de modo que un exón que normalmente debería incorporarse es pasado de largo. B. La eliminación de 173 nucleótidos de la zona codificadora del mRNA causaría un cambio en la pauta de lectura de la traducción a aminoácidos. Como un codón contiene tres nucleótidos, la pérdida de 173 nucleótidos no corresponde a un número entero de codones. Por lo tanto, la Smilina codificada por el mRNA escindido sería normal hasta el exón perdido, pero contendría una secuencia de aminoácidos sin relación alguna con la normal a partir de ese punto y hasta alcanzar el codón de paro. C. La explicación más sencilla es que el gen de la Smilina contiene un exón de 173 nucleótidos (el exón 2 de la Figura 6–50A) que se pierde durante el procesamiento del mRNA precursor del mutante. Esta pérdida podría ocurrir, por ejemplo, si la mutación cambiara el sitio de maduración de 3′ del intrón precedente de manera que no fuera reconocido por la maquinaria de corte y empalme (un cambio en el AG conservado en el límite intrón-exón podría tener este efecto). El uso del siguiente sitio de maduración 3′ disponible –adyacente al exón 3– provocaría la pérdida del exón 2 del mRNA mutante (Figura 6–50B). Durante la síntesis de proteínas, la ausencia del exón 2 (173 nucleótidos) desviaría a los ribosomas de la correcta pauta de lectura al pasar del exón 1 al 3. Al llegar a esa unión, los ribosomas empezarían a sintetizar una secuencia de proteína que no tendría nada que ver con la codificada normalmente por el exón 3. 6–28

La afirmación C es la única necesariamente cierta para los exones 2 y 3. También es cierta para los exones 7 y 8. Las afirmaciones A y B podrían ser ciertas, pero no tienen que serlo necesariamente. Dado que la secuencia proteica es la misma en los segmentos del mRNA que corresponden a los exones 1 y 10, ninguna elección de exones alternativos (entre el 2 y el 3, o entre el 7 y el 8) alteraría la pauta de lectura. Para mantener la pauta de lectura normal –sea la que sea– los exones alternativos han de tener un número de nucleótidos que, una vez dividido por 3 (el número de nucleótidos de un codón), deje el mismo resto. Como la secuencia del gen de la α-tropomiosina es conocida, es posible comprobar la situación real. Los exones 2 y 3 contienen el mismo número de nucleótidos, 126, que es divisible por 3 sin dejar ningún resto. Los exones 7 y 8 también contienen el mismo número de nucleótidos, 76, que es divisible por 3 con un resto de 1.

Figura 6–50 Maduración por corte y empalme del transcrito de la Smilina (Respuesta 6–27). (A) Transcrito normal. (B) Transcrito mutante.

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DEL DNA AL RNA

GGTGGTGAGGCCCTGGGCAG GTAGGTATCCCACTTACAAG 00211100211100011000 00311023345563332333 12 53 EXÓN

6–29

INTRÓN

Como los intrones evolucionan más rápido que los exones, los intrones de especies diferentes serán más variables que los exones. Es difícil analizar estas secuencias a simple vista y decidir, con confianza, qué lado está más conservado. Una manera de cuantificar las diferencias consiste en escoger una secuencia, por ejemplo la de la vaca, y contar con qué frecuencia las otras secuencias difieren en cada posición, como se muestra en la Figura 6–51. Al sumar las diferencias a cada lado del límite, se hace patente que las secuencias de la izquierda son mucho más similares entre sí que las secuencias de la derecha. (Las diferencias serían similares con cualquier secuencia que se hubiera escogido para la comparación.) Por lo tanto, las secuencias más conservadas, que están a la izquierda en la Figura 6–6, corresponden a los exones y las secuencias menos conservadas, las de la derecha, corresponden a los intrones.

Figura 6–51 Suma de diferencias respecto de la secuencia de la β-globina de vaca (Respuesta 6–29). La secuencia de la β-globina de vaca se comparó nucleótido a nucleótido con las secuencias de la β-globina de las otras seis especies. La suma del número de diferencias en cada posición se indica debajo de cada nucleótido de la secuencia de la β-globina. El número total de diferencias a cada lado del límite exón-intrón (línea discontinua) se muestra en la parte inferior de la figura.

(A) MINIGÉN 1 barrido 5’-3’

5’

3’

3’

5’

3’

3’

6–30 A. Si la maquinaria de corte y empalme se uniera a un sitio de maduración e hiciera un barrido del intrón hasta encontrar el sitio de maduración complementario, utilizaría el primer sitio de maduración que encontrara. En la Figura 6–52, se muestran los productos anticipados del modelo de barrido de intrones. Si la maquinaria de maduración se uniera a un sitio de maduración 5′ y barriera el intrón hacia el sitio 3′, el minigén 1 generaría un producto (Figura 6–52A) y el minigén 2 generaría dos productos (Figura 6–52B). Por el contrario, si la maquinaria de maduración se uniera a un sitio 3′ e hiciera el barrido hacia el sitio 5′, el minigén 1 generaría dos productos (Figura 6–52A) y el minigén 2, un producto (Figura 6–52B). B. Los resultados de este experimento no encajan con las expectativas de ninguno de los modelos de barrido, sugiriendo que estos modelos son incorrectos. El mecanismo por el cual las células evitan el saltarse un exón probablemente depende de dos factores: primero, que el ensamblaje del espliceosoma tenga lugar a medida que el pre-mRNA emerge de la RNA polimerasa; y segundo, que los exones puedan ser definidos en un paso independiente previo al ensamblaje del espliceosoma.

barrido 3’-5’

+

(B) MINIGÉN 2 barrido 5’-3’

Referencia: Kuhne T, Wieringa B, Reiser J & Weissmann C (1983) Evidence against a scanning model for RNA splicing. EMBO J. 2, 727-733. 6–31

6–32

6–33

Los intrones del grupo I escindidos son lineales y contienen la G activada en unión covalente en sus extremos 5′. Los intrones del grupo II escindidos forman lazos, en los que la A activada ha reaccionado con el nucleótido del extremo 5′ del intrón. El mecanismo de maduración del pre-mRNA catalizado por el espliceosoma es más similar al mecanismo utilizado por los intrones autoeditables del grupo II. “Listo para la exportación” significa que un mRNA está unido al juego apropiado de proteínas. Deben estar presentes proteínas tales como el complejo de unión de la caperuza, el complejo del límite del exón y la proteína de unión a la cola de poli-A, mientras que otras proteínas, como los componentes del espliceosoma, deben estar ausentes. Los fragmentos de RNA de los intrones escindidos no adquieren el juego necesario de proteínas y, por lo tanto, están condenados a la degradación. La estructura del nucléolo depende de los genes de rRNA, que se localizan en grupos en las puntas de cada copia de cinco cromosomas diferentes en los seres humanos. Durante la interfase, los genes rRNA transcritos se asocian para formar el nucléolo visible. Durante la mitosis, los cromosomas se dispersan y el nucléolo se deshace. Tras la mitosis, los extremos de los cromosomas vuelven a coalescer y el nucléolo se vuelve a formar en un proceso que depende de la transcripción de los genes rRNA.

5’

5’

3’

5’

3’

+

barrido 3’-5’

5’

Figura 6–52 Productos esperados en una prueba de barrido de intrones (Respuesta 6–30). (A) Productos esperados para el barrido 5’-3’ y para el barrido 3’-5’ del minigén 1. (B) Productos esperados para el barrido 5’-3’ y para el barrido 3’-5’ del minigén 2. Las cajas blancas indican exones completos; las cajas sombreadas representan exones parciales.

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Capítulo 6: Cómo leen las células el genoma: del DNA a la proteína

CÁLCULOS 6–34 A. Como la RNA polimerasa está bloqueada por los dímeros de pirimidina, la sensibilidad de la transcripción al daño por la irradiación UV dependerá de la distancia entre el promotor de un gen y la sonda. Es una medida simple del tamaño de la diana por el daño de la irradiación UV. Si la polimerasa debe viajar el doble de esta distancia para completar el transcrito, las posibilidades de que se encuentre con el bloqueo son el doble de grandes. B. La transcripción del gen Vsg es siete veces más sensible a la irradiación UV que la transcripción de una unidad de transcripción ribosomal en el sitio de la sonda 4 del rRNA, que está a unas 7 kb de su promotor (Figura 6–9A). Por lo tanto, el inicio del gen Vsg, que es donde se localiza la sonda, está a unas 50 kb (7 × 7 kb) de su...