Manual de Prácticas de Laboratorio Ingeniería de Reactores y Biorreactores PDF

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Manual que se utiliza para el laboratorio de Ingeniería de Reactores y Biorreactores dentro de la planta piloto de la UPIBI..................................................................................................................................................................................

Description

Instituto Politécnico Nacional Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología Departamento de Bioingeniería Academia de Ingeniería de Bioconversiones.

Manual de Prácticas del Laboratorio de Ingeniería de Reactores y Biorreactores

Unidad de aprendizaje: Ingeniería de Reactores y Biorreactores Carrera: Ingeniería Ambiental Nivel: VI

Carlos Orozco Álvarez Leobardo Ordaz Contreras Sergio García Salas Agosto 2017

Manual del Laboratorio de Ingeniería de Reactores y Biorreactores

Índice Práctica 1. Diseño mecánico e instrumentación de un biorreactor ......................................... 3 Práctica 2. Agitación, aireación y mezclado......................................................................... 16 Práctica 3. Determinación de la VTO (velocidad de transferencia de oxígeno) .................. 22 Práctica 4. Axenia y operación axénica de biorreactores ..................................................... 30 Práctica 5. Implementación tecnológica de sistemas fermentativos: cultivos en lote, cultivos en lote alimentado y cultivos continuos. .............................................................................. 34 Práctica 6. Limpieza y esterilización de recipientes, tuberías, aire y medios de cultivo...... 48

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PRÁCTICA 1

Práctica 1. Diseño mecánico e instrumentación de un biorreactor

Diseño mecánico e instrumentación de un biorreactor

1. INTRODUCCIÓN Un biorreactor puede ser definido como todo aquel recipiente o contenedor en el que, mediante un “biocatalizador”, ciertas materias primas son transformadas a productos. Es semejante a un reactor utilizado en la industria química en el que los reactantes, al ponerse en contacto entre ellos, reaccionan con ayuda de un catalizador de naturaleza química para formar productos. La elaboración de bebidas alcohólicas, la producción de productos lácteos fermentados, la producción de insulina humana con tecnología del DNA recombinante, son ejemplos de procesos en los que se emplean biorreactores. A la transformación de una materia en un producto de interés comercial por acción de un biocatalizador, se denomina bioproceso.

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A partir de la segunda guerra mundial los biorreactores han sido ampliamente usados en la industria de fermentaciones o en la productora de biológicos y farmoquímicos, para elaborar los tipos de productos arriba mencionados. Entre las características que debe reunir un biorreactor se encuentran las siguientes:     

Calidad de mezclado; incluyendo tiempo de mezcla y patrones de flujo que favorezcan tanto la distribución de la materia prima en el biorreactor como su conversión a producto. Altas velocidades de transferencia de masa, momento y calor, a bajo costo o con economía aceptable. Factibilidad técnica y económica en la construcción de unidades de gran volumen. Bajos costos de operación y mantenimiento. En la gran mayoría de los casos debe garantizar una operación aséptica (exceptuando los ambientales).

Independientemente del tamaño y forma de operación de los biorreactores, una forma de clasificarlos es la que se muestra a continuación: Agitados mecánicamente Biorreactores

Columna Circulación

Propelas Airlift Jet

Cada configuración tiene sus características propias, mismas que serán descritas brevemente. 1.1 Biorreactores agitados mecánicamente. Este tipo de biorreactores es muy empleado, en todas las escalas de producción, en laboratorios de investigación o en la industria de fermentaciones, pueden utilizarse incluso para fermentaciones de reología compleja y en procesos en los que se exigen altas velocidades de transferencia de masa y de calor. Consisten de un cuerpo cilíndrico con tapas elipsoidales, semiesféricas o toriesféricas. Generalmente su relación altura/diámetro es menor a 3 y más comúnmente menor a 2. Cuentan con un motor al que se acopla la flecha de transmisión que contiene a su vez los impulsores que agitarán el líquido. Dependiendo del tamaño del reactor, el motor puede colocarse en la tapa superior o en la inferior, pero invariablemente se requiere de sellos mecánicos para garantizar el trabajo aséptico. Generalmente la “aireación” se realiza a través de tubos (o placas) perforados, efectuándose la dispersión del aire en las zonas cercanas a los impulsores. A pesar de su versatilidad, sus costos de construcción, operación y mantenimiento son muy onerosos. Por limitaciones técnicas referentes a la transmisión de potencia y a los problemas

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de sostenimiento del conjunto “flecha de transmisión – impulsores”, no es posible construir unidades mayores a los 300 m3. 1.2 Biorreactores de columna. Este tipo de biorreactores carece de sistema de transmisión mecánica para mezclar el caldo de cultivo. El mezclado se realiza por la inyección de aire en el líquido desde el fondo del recipiente, al dispersarse el aire en burbujas y al ascender causan la turbulencia del líquido. Generalmente la relación altura/diámetro es mayor a 3. Si las columnas son grandes se pueden emplear platos perforados colocados en posiciones intermedias de las mismas para “redispersar” las burbujas de gas. Al carecer de partes “móviles” tanto la construcción, operación y mantenimiento de este tipo de biorreactores son más económicos que cualquier otro tipo. Quizá el mayor gasto de operación sea el de compresión de aire, en razón de los altos flujos requeridos. Generalmente se emplean para fermentaciones de baja viscosidad. 1.3 Biorreactores de circulación. La denominación de estos tipos de reactores se debe al patrón definido de circulación del líquido en el reactor. Se clasifican en dos grandes grupos: de circulación externa o interna. Externa si el flujo del líquido es inducido a circular por un brazo lateral conectado al cuerpo principal del biorreactor en su parte inferior y superior (figura 1d), mientras que es interna si el líquido circula en forma definida sin salir del cuerpo principal del reactor (figura 1c). Los primeros solo se han empleado a nivel experimental, mientras que los segundos se han llegado a utilizar a nivel industrial, generalmente en el tratamiento de aguas residuales, alcanzando volúmenes de hasta 13,600 m3. En la figura 1 se presentan algunos tipos de biorreactores. A partir de que el ser humano toma conciencia de que los altos índices de contaminación de las aguas, del suelo y del aire afectan negativamente su salud y la del medio ambiente en la que vive, los biorreactores han sido exitosamente empleados en el área ambiental para disminuir, en buena medida, los índices de contaminación. Existen varias diferencias entre los biorreactores empleados en los procesos biotecnológicos con aquellos utilizados en el área ambiental, como puede constatarse en la Tabla 1. Respecto al bioproceso, la diferencia principal radica en que en los primeros se produce un producto de naturaleza muy distinta a las materias primas empleadas (teniendo el producto un valor agregado mayor -y hasta mucho mayor- que las materias primas empleadas), mientras que en los segundos el “producto” resulta ser la misma materia prima empleada pero sin rastros de “contaminantes”, como en los casos de tratamientos de aguas, aire y suelos. De la definición de biorreactor mostrada anteriormente, pueden verse 4 aspectos principales relativos a ellos que son: a) la naturaleza del biocatalizador; b) la naturaleza y concentración de los reactantes (sustratos) y productos; c) las condiciones fisicoquímicas y operacionales

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que prevalecerán en el biorreactor; d) el material, forma, tamaño y modo de operación del biorreactor.

Aire

Aire

Dt = 45 Tubo de arrastre

Aire Aire

Bafle

Aire Airlift

Aire Columna de burbujeo

Tanque agitado mecánicamente

Figura 1. Esquemas de algunos tipos de biorreactores.

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Tabla 1.- Diferencias entre los biorreactores empleados en los procesos biotecnológicos con aquellos utilizados en el área ambiental Del área biotecnológica Del área ambiental Catalizador Se emplean tanto microorganismos, Por lo general, se emplea células animales o vegetales o partes como biocatalizador a una biológicamente activas de ellas (enzimas gran asociación de generalmente), generalmente en estado microorganismos “puro”, evitando la presencia de otros heterogéneos cuyas “entes” biológicamente activos. Sólo en poblaciones van cambiando muy pocos casos se emplean conforme se desarrolla el “asociaciones” de microorganismos bioproceso. (cultivos mixtos) que no suelen sobrepasar más de 3 tipos distintos. Sustratos Generalmente con un grado de pureza Con una extraordinaria empleados elevado, de composición constante, no variación en su composición tóxicos. Poco margen de sustratos y con niveles de toxicidad muy altos. Las composiciones de los influentes llegan a variar con el tiempo. Condiciones de La gran mayoría son sistemas aeróbicos, Existen tanto procesos aerobiosis con muy pocos casos de anaerobiosis. aeróbicos como anaeróbicos. En los aeróbicos, la velocidad de transferencia de oxígeno es un factor crítico Condiciones de Generalmente asépticos No asépticos, sin embargo, Asepsia deben existir medidas de seguridad en el manejo de los biorreactores para que el personal no resulte afectado microbiológicamente. Velocidades de Debe asegurarse que los valores óptimos Debido a los grandes transferencia de de la temperatura, de la presión y del pH, volúmenes empleados, masa, calor y se mantengan constantes durante la pueden permitirse variaciones momento biorreacción más amplias en sus valores. alcanzadas Tiempos de Generalmente comprendida en el intervalo Normalmente en días duplicación de de minutos hasta horas. la biomasa empleada Dimensiones Varían de acuerdo a la clasificación del Generalmente de grandes producto a producir (de alto volumen de volúmenes. Se han llegado a producción y bajo valor agregado o de construir unidades de hasta 1500 m3. bajo volumen de producción y alto valor 3 agregado), desde 0.050 hasta 300 m .

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Materiales de construcción

Se utilizan principalmente materiales inertes tales como aceros inoxidables, vidrio, plásticos de uso farmacéutico, etc.

Modos de operación

En su gran mayoría cerrados (en lote), le siguen los semicontinuos y por último los continuos.

Mezclado

La intensidad de mezclado a manejar está en función de la capacidad con que el biocatalizador soporte los esfuerzos de corte generados por el sistema de agitación mezclado: Las levaduras y bacterias soportan altos esfuerzos de corte; hongos, células animales y vegetales no soportan altos esfuerzos de corte. Muy altos por unidad de volumen

En reactores anaerobios la intensidad del mezclado no representa un factor crítico

Muy altos

De bajos a moderados

Muy altos

De bajos a moderados

En el orden de minutos a horas

Generalmente en el orden de días

Normalmente entre 4 y 8 Existe la necesidad de controlar de manera precisa variables tales como pH, temperatura, concentración de oxígeno disuelto, intensidad de agitación, flujo de aire, etc., a valores que se saben óptimos para la biorreacción. La medición de variables generalmente se realiza “in situ” o “en línea” mediante sensores que deben soportar las condiciones en las que se efectúa la biorreacción y las que soporte el biorreactor en todas sus etapas (incluida la esterilización). Así, el mantenimiento preventivo y correctivo de los sensores resulta fundamental y la instrumentación es costosa.

Normalmente entre 5 y 8 Normalmente la medición de las variables de la biorreacción (pH, concentración de materia orgánica, concentración de lodos, etc.) se realizan fuera de línea. De esta manera resulta más difícil el mantenimiento preciso e instantáneo de las variables de proceso.

Costos de construcción Costos de operación Costos de mantenimiento Tiempo de residencia hidráulico pH Medición y control de variables de operación y de proceso

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Materiales no convencionales pero inertes, tales como plásticos de uso rudo (PVC, acrílicos, lucita, etc.) hasta concreto. Generalmente continuos

Bajos por unidad de volumen

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Estos 4 aspectos se describen en forma breve: a) NATURALEZA DE LOS BIOCATALIZADORES Como biocatalizadores se han empleado microorganismos, células animales o vegetales o partes biológicamente activas de ellas (enzimas generalmente). Pueden emplearse en estado “puro” como en la industria de fermentaciones o como “mezclas de distintas especies biológicas” (cuando se emplean microorganismos se dice que existe una mezcla de cultivos microbianos) como en el tratamiento de aguas residuales domésticas o industriales. Los organismos biológicamente activos más comúnmente empleados en la industria biotecnológica o en el tratamiento de aguas son aquellos clasificados como heterótrofos aerobios o anaerobios. En términos generales, los heterótrofos necesitan carbono, nitrógeno, fósforo y trazas de metales y otros elementos contenidos en ciertas sustancias orgánicas e inorgánicas, comúnmente denominadas, “fuentes”, para llevar a cabo sus reacciones metabólicas y reproducirse. Dependiendo del género y especie del microorganismo, sus necesidades ambientales y nutricionales serán distintas. b) NATURALEZA Y CONCENTRACIÓN DE SUSTRATOS En la industria de fermentaciones se han empleado una gran variedad de fuentes de carbono, de nitrógeno, de fósforo y de los otros elementos, con los cuales se prepara un “caldo de cultivo” de donde el microorganismo tomará los necesarios para crecer y para producir el producto de interés. En los procesos de tratamiento (de agua, aire o suelo), los “caldos de cultivo” resultan ser nuestras fuentes naturales de agua, aire o suelo, que han sido contaminadas con sustancias orgánicas e inorgánicas extrañas a ellas que provienen de las actividades propias del ser humano. El problema de la contaminación de nuestras fuentes naturales es de tal magnitud que se hace necesario un esfuerzo conjunto entre sociedades y gobiernos para su solución a corto y mediano plazo. La naturaleza de los elementos contaminantes de las fuentes naturales depende tanto de la actividad humana (o industrial), como de la fuente misma. Los elementos contaminantes del aire son predominantemente “gaseosos”, aunque también los hay sólidos de tamaños muy pequeños o finos como residuos de combustibles fósiles mal quemados y polvos de distinta índole (esporas de microorganismos, materia fecal, etc.). Los contaminantes de las aguas pueden ser líquidos, sólidos y en menor proporción los gases. Los líquidos y sólidos pueden ser miscibles y solubles o inmiscibles o insolubles. En el caso del tratamiento de aguas (por ejemplo), los materiales orgánicos solubles, insolubles o en estado coloidal que contaminan las aguas a tratar, pueden ser utilizados como fuentes de carbono por parte de los microorganismos, quienes los mineralizarán, degradarán y transformarán en otros compuestos más sencillos y de más fácil eliminación (ej.: CO2, CH4) o bien los incorporarán al proceso de síntesis de nuevo 9

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material celular y, por lo tanto, concentrados en la biomasa misma. Esta última puede entonces ser eliminada con más facilidad por procesos de separación sólido-líquido, resultando en una disminución de la contaminación del agua tratada. c) CONDICIONES FISICO-QUÍMICAS Y OPERACIONALES DE LOS BIORREACTORES Entre las condiciones físicas, químicas y operacionales a tener en consideración cuando se trabaja un bioproceso en un biorreactor están: dentro de las físicas están la temperatura, la presión, las velocidades de transferencias de masa, calor y momento; dentro de las químicas se pueden mencionar el pH, las concentraciones de los biocatalizadores, de los sustratos y de los productos; por parte de las operacionales se encuentran la intensidad de agitación de la mezcla de reacción, los flujos de entradas y salidas de aire o de sustratos y productos (si existen); etc. Los valores a manejar de estas condiciones están supeditados a la naturaleza propia del biocatalizador. Los distintos agentes biológicos (microorganismos o enzimas) tienen sus requerimientos físicos y químicos para trabajar de manera óptima y realizar eficientemente la transformación de las materias primas a productos, por lo que será necesario establecer dichas condiciones en el biorreactor. Mientras que en los bioprocesos de elaboración de biológicos resulta fundamental mantener constantes los valores óptimos de pH, temperatura y presión mediante finos y precisos sistemas de control, así como mantener la pureza del cultivo, en los procesos de tratamiento de aguas, aire o suelos, los valores pueden llegar a variar sustancialmente, incluyendo las poblaciones microbianas. Se sabe que en un proceso de tratamiento de aguas, las poblaciones microbianas responsables de la degradación de la materia orgánica, fluctúan sustancialmente de un biorreactor a otro e incluso en un mismo biorreactor. d) MATERIAL, FORMA, TAMAÑO Y MODO DE OPERACIÓN DEL BIORREACTOR Existe una gran variedad de materiales, formas, tamaños y modos de operación de los biorreactores que resultaría inagotable su tratamiento en esta práctica. Respecto a los materiales se han usado vidrio, aceros (generalmente inoxidables), plásticos, maderas, etc. Independientemente del uso del biorreactor, entre los aspectos principales a tomar en cuenta para la selección del material de construcción están: i) que sean inertes a la biorreacción, ii) el costo, iii) la facilidad de manejo y de construcción de unidades pequeñas y de grandes volúmenes. En cuanto a formas van desde los cilíndricos hasta los cúbicos con dimensiones variables. A pesar de que existen varias formas de clasificar los modos de operación de los biorreactores, una de ellas y quizá la más generalizada es la siguiente: i) en lote o discontinuo, ii) semicontinuos, iii) continuos. Cada uno de estos modos o formas de operación tienen sus ventajas y desventajas cuando se relacionan a 2 aspectos principales que son la productividad y la seguridad tanto de la operación del biorreactor como de la del producto final. A pesar de que los procesos continuos poseen mayor 10

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productividad que los procesos en lote, estos son más ampliamente utilizados en procesos en gran escala por la seguridad y economía que representa el manejo del biorreactor y la seguridad del producto final. La mayor productividad de los sistemas continuos y semicontinuos respecto del lote es la disminución en gran medida de los tiempos muertos. La operación continua es, en teoría, indefinida, mientras que en el lote tiene un tiempo finito característico de las condiciones de la biorreacción. En los sistemas continuos existe una variable característica muy importante que es el tiempo de residencia (tr) o la velocidad de dilución (D), la cual se tiene que establecer para el sistema de biorreacción en particular. Otra forma de clasificar los modos de operación de los biorreactores es en cerrados y abiertos. El modo de operación en lote se considera un sistema “cerrado”, mientras que el semicontinuo y el continuo se consideran “abiertos” al existir corrientes de entrada y salida en el biorreactor. Estas 2 últimas clasificaciones pueden trabajar en forma aséptica o no. En el caso de los biorreactores utilizados en los siste...