Microfilaments d\'Actine PDF

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L3 : biologie cellulaire, cytosquelette : microfilaments d'actine...

Description

Biologie cellulaire :

Les microfilaments Introduction : Il existe 3 types de filaments dans la cellule : – Microfilaments d'actine : les plus fins, 7 nm de diamètre. Protéine intracellulaire la plus abondante. – Microtubules : 20-25 nm de diamètre. – Filaments intermédiaires : 10-14 nm de diamètre. Le cytosquelette est responsable de la forme de la cellule. Marquage : phalloidine-rhodamine. On a alors des traits importants qui traversent la cellule. On les appelle les fibres de stress = faisceaux de microfilaments dans un fibroblaste en culture, après marquage de l'actine avec la phalloidine couplée à un fluorochrome. Sur les bords : on retrouve l'actine du réseau sous-cortical. En ME on voit bien l'intérieur de la cellule si on enlève la membrane plasmique. Avec un grossissement plus important on voit des filaments très fins, la structure est dendritique. Le cytosquelette d'actine est remodelé sans cesse. Life-Act-RFP → fixe les filaments d'actine (partie peptidique), RFP est une molécule de la même famille que la GFP. On peut donc visualiser un signal lumineux. Cette technique permet de ne pas altérer l'activité des microfilaments. La migration des cellules (cellules sanguines, cellules cancéreuses) dépend du cytosquelette d'actine. A l'échelle plus grande : l'activité des cellules musculaires dépend aussi de l'actine et du remodelage des microfilaments.

I.

Actine et microfilaments.

1.

Caractéristiques biochimiques (Actine G = globulaire).

a. Extraction. Découverte du cytosquelette est faite pendant les années 40. La première extraction est faite des cellules du lapin. On plonge les cellules dans différents bains avec différents tampons. Les tampons ont une faible force ionique = on fait éclater les cellules. On va garder alors tout le matériel filamenteux et tout ce qui est accroché à ce matériel. Dernier bain : acétone. On solubilise les lipides = on enlève tout le contaminant de la membrane. Dans les conditions normales l'actine G est monomérique. Mais elle peut polymériser et donner de l'actine filamenteuse. Pour cela on la met dans un tampon spécifique. On fait plusieurs cycles et ainsi on filtre l'actine. En fonction du dernier tampon utilise : actine G ou F. Actine est capable d'interagir avec un très grand nombre de constituants cellulaires.

b. Evolution et isoformes. Chez les humains avec le protocole vu on extrait l'actine α-S (muscle strié squelettique). Il existe aussi : α-C (muscle strié cardiaque), α-SM (muscle lisse), γ-SM, γ-cytoplasmique et βcytoplasmique (dans toutes les cellules non musculaires). Pour les distinguer on doit faire une séparation selon le point isoélectrique. Sur l'échelle acide → base on a : α-β-γ. Actine G : 43 kD et 375 acides aminés, tandis que les formes β et γ ont 374 acides aminés. Les différentes isoformes existent car dans le génome humain nous avons 6 gènes pour l'actine. Elle est exprimée dans tout le règne animal, mais aussi chez les plantes, champignon et certains eucaryotes. Le nombre de gènes différents varie entre les espèces, ex : 1 chez les levures. Dans un tube à essaie : les différents types d'actine peuvent polymériser et former une structure hétérogène. Dans les cellules ne polymérisent pas entre elles.

Actine γ = fibres de stress, car structures très denses qui se situent très proche dans la cellule. L'actine β est retrouvée en revanche sur la périphérie de la cellule. La charge nette des filaments formés avec la forme β est plus grande. Ces structures vont repousser l'actine γ.

de

c. Structure de la molécule. L'actine toute seule n'est pas purifiante car pour se trouver sous forme d'un monomère doit être en présence d'un tampon spécifique. Pour déterminer la structure de la molécule les chercheurs ont utilisé l'interaction entre l'actine et la DNase I. Domaine interne/externe : au moment de la polymérisation ce domaine va se trouver plutôt à l'intérieur, et le domaine externe sera plutôt à l'extérieur. Les domaines peuvent se déplacer l'un par rapport à l'autre : avant/arrière, droite/gauche. Sillon (espace entre les deux domaines) est très important pour l'activité de la protéine : ici vient se loger un nucléotide → ATP ou ADP. Un autre sillon : lieu ou vient se loger l'ABPs = actin binding protein.

2.

Polymérisation (actine F).

Les monomères sont décalés l'un par rapport à l'autre de 166,6º, espace de 2,76 nm. Au bout de 14e monomère ajouté on est exactement dans le même axe que le 1er. Sous forme monomère l'actine G a ses deux domaines décalés l'un par rapport à l'autre, dans le sillon on a l'ATP. Quand l'actine va polymériser les deux domaines vont se mettre dans le même axe, cela favorise l'hydrolyse de l'ATP. Attention : ATP n'est pas nécessaire pour la polymérisation. Dans une solution de monomères : phase de latence = le temps que le trimère d'actine se forme = nucléation. À partir de ce moment là on est dans la phase exponentielle, allongement des deux côtés. Phase de plateau : le filament ne s'allonge plus, changement des monomères des deux côtés. Interaction entre les monomères est plus forte s'ils sont associés à l'ATP. Si les monomères sont associes à l'ADP on peut dans ce cas avoir une dépolymérisation. Cela maintient la langueur des polymères.

3.

Polarité et dynamique du tapis roulant.

La polarisation est possible des deux côtés, mais on distingue l'extrémité barbue (+) et l'extrémité pointue (-) car la vitesse de polymérisation est différente.

II.

Les ABPs = Actin Binding Proteins.

1.

Les ABPs liant l'actine monomerique, les profilines et les thymosine-β.

Dans la cellule on a un tas de ABPs qui vont venir réguler les microfilaments de façon différentes. Certaines se lient à l'actine G pour garder un taux stable de l'actine G dans la cellule. Les autres ont une activité de pontage. Certaines vont favoriser la nucléation. Certaines protéines peuvent fragmenter les polymères formés. Les autres font de la réticulation → assemblage des filaments en réseau ou faisceaux. → Profilines : on désigne la famille des profilines. Cette protéine (plus petite que l'actine) s'associe avec l'actine, endroit particulier = petit sillon. Chez les animaux : profiline 1, 2 et 3, dont 1 est majoritaire. Elle a de l'affinité pour le monomère de l'actine. En général : si un monomère est libéré à l'extrémité pointue → association avec une profiline. Si monomère+profiline → s'associe plus rapidement avec l'extrémité barbue (vitesse x4). Cela a aussi une incidence du côté pointu → baisse la vitesse d'association. Mais cela ne modifie pas la de polymerisation de cote pointu. Profiline a une affinité pour les monomères+ADP, si association → accélère l'échange pour passer de l'ADP vers l'ATP. Cela favorise le mécanisme du tapis roulant (aussi en faveur de la polymerisation). Inhibiteurs : le PIP2 → va être capable d'inhiber l'interaction profiline/monomère.

→ Thymosines-β : à la base sont des hormones qui étaient extraites de thymus. C'est un petit peptide peu organisé. Chaque hélice de la thymosine vient se loger dans le sillon. La thymosine a un effet inhibiteur sur la polymérisation. Rôle principal : séquestrer l'actine G+ATP dans le cytoplasme. Elle a de l'affinité pour l'actine+ATP+Mg2+. En extremite N-Term : l'helice de N-Term est un domaine WH2 (WASp Homology Domain).

2.

Les ABPS fragmentant les microfilaments, les ADF/cofilines et les gelsolines.

→ Les ADF/cofilines : fragmente les polymères de l'actine. Ont des domaines cofilines, les helices vont se loger dans le petit sillon de l'actine. Si cofiline+monomère (la majorité du temps actine+ADP), bloque le changement ADP → ATP, mais cela n'est pas le rôle principal. Rôle principal : s'associe aux côtés de microfilaments, sur les actines+ADP → provoque un changement de conformation de l'actine → cassure du microfilament. Peut aussi s'associer aux actines+ADP+Pi, dans ce cas elle va accélérer la libération du phosphate (joue sur la demi-vie). Globalement : le rôle de la cofiline dépend de sa concentration, la situation la plus courante dans la cellule = concentration basse (voire pas de protéine). Pourquoi une régulation de cette concentration ? La cofiline, pour fonctionner, doit être active. Pour être active → déphosphorylation nécessaire, assurée par les phosphatases cofilines. La phosphorylation par les LIM kinases. Autre niveau de régulation : PIP2, lie par la cofiline et va séquestrer l'actine des microfilaments. → Gelsolines : super famille de protéines. Ces protéines ont 6 domaines gelsolines. Régulées par elles-mêmes, également par le Ca2+. Fonctionnement : dans chaque domaine on a une hélice, les hélices des domaines 1, 2 et 4 se logent dans le petit sillon de l'actine. La gelsoline via les domaines 1, 2 et 4 se lient aux actines dans un microfilaments. Au niveau de l'extrémité barbue : si la concentration en Ca2+ augmente → criblage du microfilament. Les trois domaines s'associent sur 3 monomères de microfilament → gène stérique → cassure du microfilament. Une fois que le microfialement est cassé, la gelsoline reste associée au microfilament (filament coiffé). Le PIP2 va pouvoir inhiber voire gêner l'interaction entre la gelsoline et le microfilament.

3.

Les ABPs de nucléation des microfilaments, Arp2/3 et les formines.

→ Le complexe Arp2/3 : on distingue les Arp2, Arp3 et 5 ARPC. A la base dans la cellule le complexe est inactif. Pour que le complexe soit actif → Arp2 et Arp3 doivent être suffisamment proches. Ont une structure très très proche de l'actine, donc c'est comme si on avait déjà 2 actines pour la nucléation. Arp2/3 constitue alors l'extrémité pointue ce qui permet l'élongation du côté

barbu. WCA = protéine de régulation, permettent l'activation du complexe → mettent dans une conformation correcte. Il va pouvoir s'associer avec la première actine+ATP.

Régulation du complexe Arp2/3 : – WASP – N-WASP – SCAR/WAVE Ces protéines ont des différents types de domaines : WH2 → domaine de liaison à l'actine G, C et A → domaines de liaison au complexe Arp2/3. Pour l'activation totale une autre étape est nécessaire → B → lie PIP2, GBD (GTPase Binding Domain) → lie cdc42. On aura alors l'activation du complexe Arp2/3, l'activation maximale si les deux sont liés. Le domaine PP = proline-proline. Ce domaine permet de fixer la profiline. → Les formines :

– – – –

FH2 : s'associent à l'extrémité barbue du filament, on peut avoir deux domaines FH2 FH1 : fixe les profilines ou profilines actives G : activation si fixation de Rho (=GTPase) DID et DAD : interagissent ensemble → inactivation

Un microfilament avec côté pointu et barbu. Dimères de formine ont une affinité pour le côté barbu, si conformation ouverte → arrivée de l'actine et ajout de monomère sur le filament. Si conformation fermée = rien ne se passe. Sont assez processivez.

4.

Les ABPs régulant l'élongation des microfilaments, Ena/VASP et les formines.

→ Ena/VASP : ces protéines sont ubiquitaires. Domaine de régulation : – Coiled coiled : permet la tétramérisation – GAB FAB : actine binding domain, actine-G et actine-F – Région riche en proline : fixe les profilines. Si se fixe sur l'extrémité barbue : favorise la fixation de l'actine-G ou l'arrivée de profilineactine. Contrairement aux formines : pas d'activité de nucléation. Peu processives.

5.

Les ABPs de coiffage.

La coiffe se fixe sur les extrémités et ainsi bloque la polymérisation. – Extrémité barbue : famille des CP – capping protein (protéine de coiffe). Les CP sont ubiquitaires, CapZ, β-actinine (muscle squelettique). Autres protéines de coiffe extrémité + : CapG (domaine gelsoline), adducins (hématies), EPS8 (EGF receptor kinase substrate 8). L'association est régulée : certains facteurs vont inhiber par la gène stérique, d'autres vont faire des phénomènes d'activation par le phénomène allostérique. – Extrémité pointue : tropomoduline → stabilise l'extrémité et le complexe Arp2/3. 6.

Les ABPs de réticulation des microfilaments.

Ces protéines possèdent un domaine de liaison à l'actine = ABD. On a des fimbrines/plastines, α-actinine (dimère, association de deux molécules, deux domaines de liaison à l'actine, 40 nm), filamine/ABP (dimerisation nécessaire pour le fonctionnement, chaque monomère a un seul domaine de liaison à l'actine → stabilisation du réseau dendritique).

7.

Les ABPs se liant aux microfilaments.

Les tropomyosines : se lient latéralement sur toute la longueur des microfilaments. Rôle : stabilisation, protègent les MF contre les ABPs qui ont une activité de fraction, régulation qui va autoriser ou pas une interaction avec des protéines, régule la contraction musculaire.

8.

Liaison des drogues et autres ligands.

– Cytochalasine D : dissociation des microfilaments comme conséquence ? – Latrunculine B : association avec les monomères ? – Phalloïdine : capable de s'associer à certains endroits de MF. Toxine dangereuse, conséquences : stabilisation, impact sur les cellules musculaires. Utilisation sur les cellules fixées → permet de visualiser les MF si couplé à un fluorochrome. LifeAct : utilisation de 17 aa (motif minimal pour la liaison) d'une protéine qui se lie a l'actine, couplage a une protéine fluorescente, le peptide s'associe latéralement aux MF, ne perturbe pas trop l'activité et la dynamique des MF.

III. Les moteurs moleculaires associés à l'actine, les myosines. 1.

Structure générale des myosines.

Myosines : super-famille, on a 34 ou 35 familles (35e → le reste qu'on n'a pas placé dans les 34 premières familles). Chez les vertébrés : 18 myosines différentes, chez les plantes : 2 familles. Myosine : possède au moins une tête de myosine.

Tête, cou, queue → l'ensemble est appelée « la chaine lourde de myosine », par dessus s'associent une ou plusieurs chaines légères. Au niveau de la tête : deux parties essentielles → domaine de liaison à l'ATP et un domaine de liaison à l'actine. Queue = partie la plus variable, permet de faire le lien avec d'autres molécules, des vésicules etc.

2.

La super-famille des myosines.

Certaines myosine sont monomeriques, d'autres vont former des dimères. Si dimère : possède un domaine CC (coil-coil), joue un rôle dans l'activité de déplacement des constituants.

3.

Le cycle cinétique des myosines.

Comment une myosine se déplace sur le microfilament ?

On a au départ liaison entre actine et myosine. 1e étape : fixation de l'ATP sur la tête de myosine, la fixation d'ATP diminue l'affinité au microfilament d'actine. On a donc une séparation entre le complexe ATP/myosine et actine. Après

la séparation → hydrolyse de l'ATP → changement de la conformation de la myosine (tête et cou alignés). Etape 4 : myosine+ADP+P, retrouve une affinité avec le MF (le fait de changer la conformation → déplacement). A on a libération du phosphate → molécule va à nouveau s'incliner. Dernière étape : libération de l'ADP → on revient au complexe actine+myosine. On a un système de double mouvement. Partie « convertisseur » signale des changement au niveau de la tête vers la queue → association du mouvement de la queue.

4.

Fonction des myosines.

M2 : association aux fibres de stress, permet de transmettre l'état de tension de la cellule au cytosquelette → en culture les cellules ont des fibres de stress. a. Les réseaux sous-membranaires. Actine → forme de la cellule. Si drogue (lantraculine B vue en TP) → cellules déformées, diminution du volume.

→ Réseau d'actine des hématies : actine forme des petits MF. 3 ABPs associées à l'actine : tropomoduline (-), adducine (+), latéralement → tropomyosine. Tout ça permet de stabiliser des petits MF. Entre les complexes s'étend la spectrine (chaines alpha et beta), les chaines ont aussi un ancrage a la membrane via Band 3 (échangeur d'anions). Deuxième zone d'ancrage : glycophorine C. → Réseau d'actine des cellules musculaires striées : les MF d'actine sont ancrés à la membrane plasmique via des protéines intermédiaires.

Grand complexe moléculaire associé à la dystrophine (lie deux complexes). Si problème avec la dystrophine → myopathie. Le complexe traverse la membrane et est lié à la MEC. Dans le muscle on a l'actine alpha dans le sarcomère. Au niveau de la ligne Z → ABP qui s'appelle CapZ.

b. Les faisceaux unipolaires. Dans les cellules épithéliales, trophoblastes, cellules qui peuvent migrer et les cellules de l'oreille interne avec des stereocils → on a des prolongements de la membrane plasmique. Ces prolongements contiennent des ABPs qui permettent d'organiser ces microvillosites. La cellule qui migre, émet en avant des filopodes (moins stable que les microvillosités), l'actine organise le cytosquelette dans ces filopodes. ABPs : fascine, formine → mdia. La fimbrine et la viline permettent de lier les MF entre eux (parallèles et à une certaine distance) dans les microvillosités des enterocytes. Stereocils : sont specifiques des cellules de l'oreille interne et externe. Les stereocils sont en contacte avec la membrane basilaire, quand un son entre dans l'oreille, cela provoque le deplacement des cils → transmis comme une information nerveuse. c. Rôle des MF dans la motricité cellulaire. Ici on a des cellules qui ont besoin de se déplacer. Ex : cellules de la lignée blanche après la diapédèse ; cellules de la crête neurale. On a des differents modes de deplacement : collective (crete neurale, cellules epitheliales), mesenchymateux, amoeboid (la cellule ne s'étale pas bcp, se déforme et se déplace entre les fibres presentes dans son environnement). Cellule a des différents compartiments, et dans chaque compartiment l'organisation de l'actine est différente. Le lamelipode permet d'avancer la membrane plasmique. Pour que le reste de la cellule suive → il faut tirer. Cette tension est assurée par les fibres de stress, cette tension vient de l'activité de myosine. → Organisation dynamique des microfilaments : voir diapo resume avec le cycle de l'actine. → Interaction avec les voies de signalisation :...