Microscopi òptic PDF

Preview

Summary

BLOCS
- Components mecànics i òptics
- Mesures en microscopia
- Tipus de microscopis...

Description

EL MICROSCOPI ÒPTIC FORMACIÓ DE LA IMATGE I AUGMENT: MICROSCOPI: Instrument òptic format per lents que origina imatges virtuals i augmentades d’objectes petits. Té dos sistemes òptics: •

OBJECTIU: L’objecte se situa davant i s’obté una primera imatge real, augmentada i invertida anomenada imatge primària.

•

OCULAR: Forma la imatge final virtual (més gran i dreta), situada més o menys a 250 mm de l’ull (distància mínima de visió perfecta).

✴

Augment final: Producte de l’augment de l’ocular per l’augment de l’objectiu, donant lloc a l’augment total del microscopi. AMICROSCOPI = AOBJ X AOC

✴

Si el tub o capçal inclou altres lents s’ha de multiplicar pel factor del tub. AMICROSCOPI = AOBJ X AOC X MTUB

COMPONENTS MECÀNICS I ÒPTICS: 1. ELEMENT MECÀNICS: Donen suport a la part òptica. a. PEU: Sosté l’instrument de manera estable. b. COLUMNA: Dona suport al tub o capçal, a la platina i a la subplatina. c. TUB O CAPÇAL: En els extrems hi té l’objectiu i l’ocular, entre els quals s’hi condueix un

feix de llum des de l’objectiu fins l’ocular (longitud òptica; és de 160 o 170 mm). Poden ser monoculars o binoculars. d. REVÒLVER: Dispositiu rotatori que sosté els objectius i permet intercanviar-los i centrar-los. e. PLATINA: Superfície plana on se situa la preparació i que permet desplaçar-la. f.

SUBPLATINA: Subjecta el condensador.

g. CARGOL MACROMÈTRIC I MICROMÈTRIC: Desplaça la platina o tub per enfocar la mostra.

2. ELEMENT ÒPTICS: Formen la imatge. a. OBJECTIU: Sistema de lents convergents (doblets i triplets) a l’extrem inferior del tub que permet obtenir una imatge real,

augmentada i invertida de l’objecte. Les lents corregeixen les aberracions geomètriques i cromàtiques. b. Segons el grau de correcció cromàtica es classifiquen en: i. Acromàtics: Són més econòmics ja que tenen lents de vidre. Són utilitzats en microscopis senzills. ii. Semiapocromàtics. iii. Apocromàtics: Tenen un grau alt de correcció, ja que es substitueixen les lents de vidre per les de fluorita (mineral amb baix poder de refracció i dispersió comàtica). S’utilitzen en microscopis de gamma alta i microfotografia pel seu alt preu (gran complexitat i de fluorita).

c. Segons la curvatura de camp, hi ha objectius normals i objectius plans (s’ha suprimit la curvatura de la imatge). d. Els objectius poden: i. Secs: Entre el cobreobjectes i l’objectiu hi ha aire. ii. D’immersió: Entre la lent frontal de l’objectiu i el cobreobjectes hi ha oli d’immersió, que té un índex de refracció (n=1,515) igual que el del vidre de les lents de l’objectiu, del cobre i del portaobjectes. ✴

Els objectius actuals són parafocals; facilitant l’enfocament (mateixa distància entre l’extrem superior de l’objectiu i l’objecte).

e. Les característiques dels objectius: i.

Augment: Relació entre la grandària de l’objecte i la imatge que forma l’objectiu [Petit (4x,10x i 20x), mitjà (40x i 60x) i gran (100x)]. ✴

A més augment, s’enfoquen menys plans (dissecció òptica).

ii. Obertura numèrica (ON): Producte de l’índex de refracció (n) que hi ha entre la preparació i objectiu per sin β/2. ON = n · Sin β/2 ✴

n: Depenen del medi. El de l’oli és de 1,515, mentre que el de l’aire és d’1.

✴

Sin β/2: Fa canviar l’angle en funció de l’objectiu (major objectiu = major angle = millor visió).

✴

Els objectius d’immersió tenen una ON > 1, mentre que els secs ON < 1

Obertura numèrica

Entre la lent i el cobreobjectes hi ha d’haver oli d’immersió

Augment No necessita cobreobjectes

Gruix del cobreobjectes

Longitud òptica del tub o capçal en mm

B. Altres factors dels quals depèn la qualitat de la imatge microscòpica són: i.

Poder de resolució (PR): Capacitat de la lent objectiu per donar imatges separades de dos punts pròxims; depèn de l’obertura numèrica (ON) i de la longitud d’ona (λ) de la llum utilitzada. S’expressa amb la fórmula d’Abbe: PR = 1/d ✴

✴

d (resolució): Distància mínima a la qual poden estar situats dos punts perquè les seves imatges es vegin separades. Com més alta sigui més separats es veuran els punts. d = cte (0,61) · λ/ON (es calcula en micres). Aquesta, a diferència de l’augment (es pot incrementar sense límits), està limitada per les propietats físiques de la llum.

- Mica o micròmetre (μm): 1μm = 10-6 m - Nanòmentre (nm): 1nm = 10-9 m 1nm = 0'001 μm

- Àngstrom (Å): 1Å = 10-10 m - Picogram (pg): 1pg = 10-12 g ✴ ✴

-

Picogram (pg): 1pg = 10-12 g Dalton (d): 1d = 1,66 · 10-24 g Metro (m): 1m = 106 μm Centímetre: 1cm = 104 μm Mil·límetre (mm): 1mm = 1000 μm

- Svedberg (s): Velocitat en què precipiten les partícules en la centrífuga

Resolució màxima del microscopi òptic: 0,25 μm // ull humà: 0,15 mm. Com major sigui l’ON, major serà el poder de resolució.

ii. D’aquest depèn la capacitat de reproduir en la imatge els detalls d’un objecte (els objectius d’immersió aporten més resolució, ja que els augments presenten una obertura numèrica més gran). ii. Poder d’il·luminació: Quantitat de llum que entra en l’objectiu per formar la imatge. iii. Camp visual: Zona de la mostra que pot esser observada sense moure-la ni canviar l’enfocament. ✴

Com major sigui l’ON, major serà el camp visual.

iv. Poder de penetració o profunditat de focus: Capacitat de l’objectiu d’enfocar diferents plans a l’hora gràcies al micromètric. Els dos primers factors varien en proporció a l’obertura numèrica; els dos últims en proporcionalitat inversa. ✴

Com major sigui l’ON, menor serà la profunditat de camp.

A. En les montures hi ha anotacions per identificar-los: ✴

100x: Augment.

✴

Ac: Objectiu acromàtic

✴

1,30: Obertura numèrica.

✴

Fl: Objectiu de fluorita o semi-apocromàtic

✴

Oil: Immersió amb oli

✴

Ap: Objectiu apocromàtic

✴

160: Longitud òptica del tub o capçal en mm.

✴

PH: Objectiu de contrast de fase.

✴

0,17: Gruix del cobreobjectes. Si hi ha (-), es pot usar o no cobreobjectes; si hi ha (0) no.

✴

DIC: Objectiu de contrast interferencial de Nomarski.

✴

Plan: Objectiu pla.

b. OCULAR: Sistema òptic que dóna lloc a una imatge virtual, augmentada i dreta, de la imatge primària.

c. Poden ser positius amb el pla focal exterior al sistema òptic, i negatius amb el pla focal interior. S’anomenen oculars compensadors quan acaben de corregir l’aberració cromàtica residual que presenta la imatge primària.

• Els oculars indicadors introdueixen a nivell del pla focal senyals que permeten indicar zones de l’objecte i els oculars micromètrics insereixen reticles o divisions per valorar diferents paràmetres de l’objecte. També n’hi ha de projecció, fotogràfics, …. • S’ha de tenir en compte l’augment i l’índex de camp visual (indica l’àrea de la imatge primària visualitzada per l’ocular). c. SISTEMA D’IL·LUMINACIÓ: Dispositiu que facilita la il·luminació de la mostra per a una acurada observació. Consta de: focus lluminós,

lent col·lectora, mirall i condensador amb diafragma d’obertura. i. Condensador: Sistema de lents convergents situat a sota de la platina que concentra damunt de la mostra els feixos de llum emesos per la font d’il·luminació. Com més avall estigui, la mostra es veurà menys nítida. ii. Està equipat amb un diafragma que controla el con de llum incident sobre la mostra per millorar el contrast (si la mostra no té color es tanca, mentre que si en té s’obri). És l’element bàsic de la microscòpia de camp fosc i de contrast de fase.

MESURES EN MICROSCÒPIA: 1. MICRÒMETRE OCULAR O OCULAR MICROMÈTRIC: Disc de vidre que porta gravada una petita escala i que es col·loca dins de

l’ocular. El valor de cada divisió de l’escala varia en funció de l’augment amb què s’observa. 2. Per saber el valor de les divisions a un determinat augment, es compara l’escala de l’ocular amb la del micròmetre de platina, micròmetre objectiu o micròmetre objecte. Aquesta operació s’anomena calibratge del micròmetre ocular. Per a cada retxa:

-

Objectiu 4x = Es multiplica per 25 μm Objectiu 10x = Es multiplica per 10 μm Objectiu 40x = Es multiplica per 2,5 μm Objectiu 100x = Es multiplica per 1 μm

TIPUS DE MICROSCOPIS: a. ÒPTIC: S’utilitza per a l’observació rutinària, ja que compte amb uns límits de resolució de 0,2 μm (200nm). Tot i això, ha estat una eina

bàsica per el desenvolupament de la microbiologia i investigació. i.

Camp clar: Està integrat per dos series de lents (objectiu i ocular) que funcionen conjuntes per produir una imatge. Les mostres es visualitzen gràcies a la diferència de contrast entre elles i el medi que els envolta (es veu tot clar menys l’objecte).

ii. Camp fosc: Concentra el llum (tot fosc menys l’objecte). iii. Contrast de fosc: Passa pel diferents contrast per poder veure cèl·lules vives (no es pot veure tan clar). iv. De polarització: Només passa la llum d’una direcció (més clar). v. De fluorescència: El pas d’electrons excitats o relaxats fa que es desprengui fluorescència, tot i això, emet menys energia de la que rep. Amb una mateixa tinció es poden identificar diferents parts (sang). A partir de raigs UV s’exciten els electrons, fent que aquests deprenguin llum visible que serà d’un color o un altre depenent de la longitud d’ona amb la qual s’ha excitat, permetent així poder observar una determinada part o una altra de la mostra:

- Si els electrons s’exciten amb una longitud d’ona blava, emeten llum verda - Si els electrons s’exciten amb una longitud d’ona verda, emeten llum vermella - Si els electrons s’exciten amb una longitud d’ona vermella, emeten llum blava.

b. ELECTRÒNIC: S’utilitza per a observar estructures intracel·lulars o de virus degut a la seva elevada resolució (límit de resolució = 0,5nm).

Funciona per un sistema d’electroimants (no lents) que fan talls molt fins per permetre el pas d’electrons. ‣

DIFERÈNCIA ENTRE MICROSCOPI ÒPTIC I ELECTRÒNIC:

M. ÒPTIC

M. ELECTRÒNIC

Radiació

Llum

Electrons

Penetració de la radiació

Gran

Petita

Medi

Aire

Buit

Lents

Vidre

Electromagnètica

Augments

1.500 x

200.000 x

Límits de resolució

0,25 μm

3-4 nm

Absorció diferencial

Dispersió d’electrons

Directe

Pantalla fluorescent i placa fotogràfica

Formació de la imatge Observació de la imatge...