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Determinar la concentración a partir de la elaboración de una grafica absorbancia vs concentración ...

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO BIOLOGÍA MOLECULAR DE LA CÉLULA II

PRÁCTICA 0 CURVA PATRÓN RESUMEN La curva patrón es un método empleado para determinar la concentración de una sustancia en una muestra desconocida. Esta práctica se realizó con datos obtenidos indirectamente. Se construyó una curva patrón basada en los datos de espectrofotometría y con la ecuación, se obtuvieron las concentraciones desconocidas de dos muestras. De acuerdo a las concentraciones, se encontraron diferentes cantidades de BSA en las muestras. INTRODUCCIÓN La concentración es la medida de la proporción entre los componentes de una mezcla; se puede expresar en unidades físicas y unidades químicas (molaridad, molalidad, fracción mol y normalidad). Las medidas de concentración se basan en masa-volumen; como porcentaje en masa, porcentaje en volumen, partes por millón, fracción mol, molaridad/formalidad, molalidad, normalidad, presión parcial. Para poder medir la concentración de células o biomoléculas existentes en una muestra que se encuentra en disolución o en suspensión, se puede utilizar el espectrofotómetro. Se fundamenta al medir la intensidad de luz a una determinada longitud de onda que es capaz de absorber dicha sustancia, la cantidad de luz absorbida se expresa normalmente como transmitancia o absorbancia. (Segal, 2019) La regresión lineal se emplea para conocer qué tanto los valores de una medición se “parece” a la ecuación de una recta. Esto se debe a que algunos métodos como el de cuantificación de proteínas, se basan en ecuaciones que siguen el comportamiento de una recta, en la cuantificación de proteínas se miden espectrofotométricamente complejos coloridos a una determinada longitud de onda, en el caso de las proteínas, se calculan las concentraciones de disoluciones problemas a partir de una curva patrón. La curva de calibración o patrón es un método muy utilizado en química analítica para determinar la concentración de una sustancia (analito) en una muestra desconocida, sobre todo en disoluciones, como albúmina sérica bovina. En el procedimiento se compara una propiedad del analito con la de estándares de concentración conocida del mismo analito (o de algún otro con propiedades muy similares a éste).Tiene dos funciones en lo particular: Conocer la confiabilidad de nuestras mediciones y utilizarla como referencia para interpolar valores de nuevas determinaciones. Se debe de asegurar que los resultados siguen la ecuación correspondiente de la ley de Lambert-Beer (ec. 1) en la que a mayor concentración de sustancia se obtiene una mayor absorbancia.

Abs = εcl Donde: Abs = Absorbancia ε = Coeficiente de extinción molar

o absortividad molar c = Concentración l = Longitud de celda

 Ecuación 1. Ley de Lambert-Beer Al medir la absorbancia de una sustancia a la longitud de onda adecuada, ésta se incrementa de manera directamente proporcional a la concentración de dicha sustancia, por lo tanto se puede estimar la concentración de una proteína a partir de una curva patrón. HIPÓTESIS -Con los datos de absorbancia proporcionados se podrá elaborar una curva estándar -Mediante este uso de la curva estándar se podrán calcular las cantidades de proteína en las muestras problema. OBJETIVO GENERAL Aprender a realizar curvas patrón a partir de variables independientes y dependientes.Así como aprender a utilizar las diferentes maneras de hacer concentraciones. OBJETIVOS PARTICULARES ● ●

Identificar las proteínas presentes con la ayuda del método de Brandford. Obtención de la curva patrón a partir de distintas concentraciones.

MATERIALES Y MÉTODO Los materiales que se utilizan son micropipeta de 1 ml o jeringa de insulina, espectrofotómetro y celdas de 1 ml, 11 tubos de ensaye, gradilla y vortex. De igual forma de utiliza reactivos los cuales son 1.5 mL de solución de albúmina sérica bovina 0.2 mg/ml, 0.5 mL de solución A (proteína de concentración desconocida), 1 mL de solución B (proteína de concentración desconocida), 50 mL de Reactivo Bradford (guardar en frasco ámbar) Se debe de preparar los siguientes tubos. Para la curva estándar (tubos 1 al 6) se utiliza una solución de 0.2 mg / ml de albúmina sérica bovina (BSA). Para los tubos problema (7 al 10) se utilizan las soluciones de concentración desconocida (A y B). Se debe de mezclar bien todos los tubos, posteriormente adicionar a cada tubo 1 mL de reactivo Bradford y mezclar inmediatamente, esperar al menos 5 minutos pero menos de 1 hora, leer la A595 y anotar los datos obtenidos. Eliminar los desechos de reactivo de Bradford en un contenedor designado, si sobró solución patrón de albúmina y de las soluciones problema A y B se puede volver a congelar para que otros grupos puedan utilizarlas.

RESULTADOS A Partir de los resultados enviados por el profesor, por cada tubo se hicieron 4 lecturas de la absorbancia y a partir de esto se determinó el promedio de absorbancia para cada tubo con la concentración ya conocida (Tabla 1)

Tubos

Volu men de sol. De BSA añadi da a la muest ra µL

Variables independientes Canti Concentr dad ación de total BSA en de el tubo BSA prese nte en el tubo µg de BSA

Variables independientes Lectura 1

Lectura 2

Lectura 3

µg/mL de BSA

Lectura 4

Promedio

Absorba Absorba Absorba Absorba Absorban ncia 595 ncia 595 ncia 595 ncia 595 cia 595 nm nm nm nm nm 1 0 0 0 0.001 0 0.002 0 0.00075 2 25 5 50 0.12 0.15 0.14 0.13 0.135 3 50 10 100 0.38 0.3 0.32 0.325 0.331 4 75 15 150 0.504 0.501 0.498 0.49 0.498 5 100 20 200 0.574 0.612 0.61 0.58 0.594 Tabla 1. Concentración de BSA y absorbancia de cada tubo para la construcción de la curva patrón

A Partir de la Tabla 1, se graficó la curva patrón (Gráfica 1)

Gráfica 1. Curva patrón (absorbancia vs concentración)

Con la ecuación de la recta se calcularon las concentraciones problema, se despejo la ecuación y = 0.0031x + 0.0018 , esta ecuación se puede ver como la de Lambert-Beer (ec. 1), ejemplifica con la ecuación 2.

Se puede observar que es la ecuación lineal, y aplicándola a la ecuación que nos arrojó la gráfica 1, se puede despejar “x” que en este caso sería la concentración de BSA, la cual quedaría y−b m

(ec. 3), sustituyendo nos queda, la concentración de BSA es igual a la absorbancia menos la longitud de celda sobre coeficiente de extinción molar.

x=

Aplicando los valores correspondientes a la ecuación 3, se determinaron las concentraciones a partir de la absorbancia los resultados se muestran en la tabla 2.

Tubo s probl ema 6 7 8 9

µl de Sol. Proble ma Proble ma A 10 µl Proble ma A 15 µl Proble ma B 30 µl Proble ma B 60 µl

Cantid ad total de BSA presen te en el tubo (1) µg Prot

Conce ntració n de BSA en el tubo

Lectur a1

Lectur a2

Lectur a3

Lectur a4

Prome dio de absorb ancias

µg/mL de Prot

µl de H2O

Absorb ancia

Absorb ancia

Absorb ancia

Absorb ancia

Absorb ancia

1.010

101.03 2

90 µl

0.3157

0.308

0.319

0.318

0.315

2.290

152.57 7

85 µl

0.4704

0.451

0.489

0.49

0.475

0.940

31.354

70 µl

0.109

0.101

0.089

0.097

0.099

3.603

60.064

40 µl

0.21

0.18

0.19

0.174

0.1885

Tabla 2. Concentración de BSA a partir de la absorbancia

Tubo ml sol A

ml sol B

6 7 8 9

----0.03 0.06

0.01 0.015 -----

mg Proteína (1) 0.00101 0.00229 0.00094 0.003603

mg Proteína/ml 0.101 0.1526 0.0313 0.06005

DISCUSIÓN En la Gráfica 1, se puede observar la medición de la absorbancia de BSA, utilizando el método de Brandford el cual presenta la línea de tendencia y R2 que determina que la línea de tendencia predice la sucesión de puntos. Cuando se realizan mediciones en el espectrofotómetro es recomendable utilizar vortex ya que de esta manera no se presentan agregados de proteína-tinte, las cuales altera la lectura de las mediciones (Yanos, A., et a l ., 2013). En el método de Brandford para realizar las curvas de calibración, es común que se utilicen distintos tipos de proteínas, como lo es la BSA (albúmina sérica bovina).Ya que dicha proteína proporciona una mayor sensibilidad de la prueba. La absorbancia de una solución es directamente proporcional a su concentración a mayor número de moléculas mayor interacción de la luz con ellas; también depende de la distancia que recorre la luz por la solución a igual concentración, cuanto mayor distancia recorre la luz por la muestra más moléculas se encontrará; y por último, depende de ε, una constante de proporcionalidad denominada coeficiente de extinción que es específica de cada cromóforo. El espectro de absorción es una representación gráfica que indica cantidad de luz absorbida (ε) a diferentes valores de λ. A partir de una solución diluida de un compuesto, cuya absorbancia máxima entra dentro del rango de medida del espectrofotómetro, se verá el valor de absorbancia a diferentes longitudes de onda frente a un blanco que contenga el disolvente de la solución de la muestra a caracterizar. A partir del espectro de absorción se obtendrá el valor de λ al que el compuesto presenta la mayor absorbancia (λmax). Dicho λ se utilizará a la hora de hacer determinaciones cualitativas y cuantitativas del compuesto. El espectro de absorción de un cromóforo depende, fundamentalmente, de la estructura química de la molécula.(Nieves, 2009). CONCLUSIÓN Con los datos proporcionados, fue posible la realización de la curva estándar, con un coeficiente de determinación, aceptable. Una vez elaborada la curva y con la obtención de la ecuación se determinaron los valores de proteína en las muestras problema.

CUESTIONARIO

1. Definir los siguientes conceptos: Concentración, mol, molaridad, porcentaje (como forma de medir la concentración), número de avogadro. Concentración: Medida de la proporción entre los componentes de una mezcla. Se puede expresar en unidades físicas y unidades químicas. Mol: número de átomos que hay en una sustancia. Molaridad: Medida de concentración de un soluto en una disolución. Porcentaje: Expresión que se utiliza para medir la pureza de sólidos y líquidos; a partir de la masa del soluto entre la masa de la solución multiplicado por 100. Número de Avogadro: Cantidad de partículas que existen en un mol de cualquier sustancia.

2. ¿Cuál es la diferencia entre un mol y uno molar? Un mol es el número de átomos que hay en una sustancia y uno molar se está hablando de una disolución que se representa como 1M de sal en agua que contiene un mol de sal por cada litro de disolución, es decir donde cada cantidad indica la masa en gramos por cada mol de sustancia (g/mol). 3. ¿Qué significa que una solución esté a una concentración 2M? ¿y 2% w/v? 2 M tendrá dos moles del soluto por cada litro de disolución; 2% será el porcentaje de masa o volumen que haya en la pureza de un sólido o líquido. 4. Completar la siguiente tabla con las equivalencias correspondientes: M

mM

μM

nM

pM

1M=

1

1 000

1 000 000

1 000 000 000

1 000 000 000 000

1mM=

0.001

1

1 000

1 000 000

1 000 000 000

1μM=

0.000 001

0.001

1

1 000

1 000 000

1nM=

0.000 000 001

0.000 001

0.001

1

1 000

1pM=

0.000 000 000 001

0.000 000 001

0.000 001

0.001

1

5. ¿Para qué sirve una curva estándar? con ella es posible preparar una disolución de concentración exactamente conocida denominada solución madre; luego, utilizando la solución madre, se preparan un conjunto de soluciones a distinta concentración para la obtención de una curva de calibración. 6. ¿Cuánto debes poner de soluto y de disolvente para preparar 50ml de cada una de las siguientes diluciones? a. 1:2 ; 25 de soluto y 25 ml de disolvente

b. 1:5 ; 10 de soluto y 40 ml de disolvente c. 2:5 ; 20 de soluto y 40 ml de disolvente 7. Si tienes una solución de glucosa 1M y la diluyes 1:2 a. ¿A qué molaridad queda? 1/2= 0.5 ; entonces queda 0.5 M b. Si diluyes 1:3 la dilución anterior ¿A qué dilución final queda? 1:2*1:3= 1:6 c. ¿Qué molaridad tiene esta última solución? 1/6 = 0.16 M d. ¿Cuál es la concentración final en %? 0.16*100= 16% 8. ¿Cuántos gramos debes pesar para preparar 250 ml de (NH 4 )SO 4 (sulfato de amonio) 2M? ¿A cuánto equivale en %? Se deben de pesar 66.07 gramos de  (NH₄)₂SO₄ equivalen 26.48% 9. ¿Cuánto debes pesar para preparar 50ml de HCl 0.4%? ¿A qué molaridad queda? Se deben pesar 0.2 g de HCl y tendría una molaridad de 0.10 10. Calcule la molaridad de una solución que contiene 26g de fructosa (C 6 H 12 O 6) diluidos en 300ml de H 2 O ¿y a qué porcentaje queda? 26g fructuosa C6H12O6 C: 12 X 6 = 72 H: 1 X 12 = 12 O: 16 X 6 = 96

( 1 mol / 180 g ) = 0.0055 moles

Molaridad: 0.0055 moles C6H12O6 / 0.3 L = 0.0183  M Masa molecular Total : 72 + 12 + 96 = 180 Porcentaje en masa 26 g C6H12O6 / 300g x 100 = 8.66 % 300 ml Agua (1 g / 1 ml) = 300 g (solución) 11. En agua el NaCl se disocia y forma iones Na + y Cl - . Si preparas 50 ml de solución de NaCl 0.5M, suponiendo que todo el NaCl quedó disociado, ¿A qué molaridad quedan los iones Na + ? ¿y los Cl - ? NaCl— H2O⟶Na+ + Cl-  Molaridad de los iones Na+ = (0.5 mol NaCl / 1 L)(1 mol Na+ / 1 mol NaCl) = 0.5M  Molaridad de los iones Cl- = (0.5 mol NaCl / 1 L)(1 mol Cl- / 1 mol NaCl) = 0.5M 

REFERENCIAS ● Yanos, A., Bautista, M., Angelia, M. y del Rosario, E. (2013). Digital Photometric Determination ofProtein Using Biuret, Bradford and Bicinchoninic Acid Reagents. Philipine Science Letters, Vol.6, 168-175 ● Chang, R. 2010. Química. 10a. edición. Ed. Mc Graw-Hill. México. ● Morris, J., G.(1975). Fisicoquímica para biología. Editorial Reverte. Barcelona, España. 389 pp. ● Biología molecular-Manual de laboratorio. 2. Citología-Manuales de laboratorio. I, Segal Kischinevzky Claudia, coordinador. II Universidad Nacional Autónoma de México. Facultad de Ciencias....