PEROSSISOMI,RETICOLO PDF

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PEROSSISOMI E RETICOLO ENDOPLASMATICO...

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Argomenti: Smistamento delle proteine, Perossisomi, Reticolo Endoplasmatico, Accenni alla Glicosilazione Nella lezione scorsa, avevamo visto lo smistamento delle proteine. Quindi avevamo visto che, nel momento in cui una proteina viene sintetizzata, questa svolgerà la propria funzione in un determinato compartimento. Come arriva a livello di questo compartimento? Arriva perchè, nella sua sequenza primaria, c'è una regione che prende il nome di segnale di localizzazione. Esistono vari tipi di segnali di localizzazione, riconosciuti da altrettanti sistemi di trasporto. Per sommi capi, questi sistemi di trasporto vengono suddivisi in tre categorie: 

trasporto veicolato, come ad esempio quello attraverso i pori nucleari, che veicola il transito delle proteine dal nucleo al citoplasma e viceversa;

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trasporto ad opera di proteine traslocatrici, che si aprono lateralmente e formano un canale attraverso cui passa la proteina fino ad entrare nel compartimento interessato. Nel caso in cui la proteina sia una proteina di membrana, questo traslocatore riconosce la porzione idrofobica della proteina, si apre lateralmente e mette in contatto questa porzione idrofobica con il doppio strato fosfolipidico della membrana; trasporto vescicolare o traffico vescicolare, che avviene grazie a delle vescicole che gemmano dal compartimento di partenza e arrivano al compartimento bersaglio che può essere il Golgi, la membrana plasmatica, il lisosoma, il perossisoma e così via.

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Quali erano queste sequenze segnale? Abbiamo detto che una sequenza segnale ricca di amminoacidi basici, come l’arginina e la lisina, è la tipica sequenza di importo nucleare, che permette il recupero all'interno del citoplasma di proteine che erano state destinate al nucleo. La tipica sequenza di esporto nucleare è una sequenza ricca in leucine. Queste sequenze vengono riconosciute dai sistemi di trasporto del nucleo anche quando la proteina è strutturata, cioè è foldata tridimensionalmente, mentre tutte le altre sequenze di localizzazione, come ad esempio quelle relative al simporto nei mitocondri o al simporto nel reticolo, sono delle sequenze che vengono riconosciute solo quando la proteina si trova in uno stato unfolded, cioè non correttamente ripiegata tridimensionalmente.

Avevamo visto alcuni esempi di segnale , ad esempio di importo mitocondriale, caratterizzato da una sequenza costituita da un' alfa elica anfipatica che ha un versante idrofobico e un altro che contiene residui carichi positivamente. Per quanto riguarda la sequenza di importo a livello del reticolo endoplasmatico, la sequenza caratteristica è una sequenza ricca di amminoacidi idrofobici all'N terminale. Poi ci sono sequenze di importo perossisomale che troviamo all’estremità Cterminale e sono dette sequenze SKL. Quindi esistono tutta una serie di sequenze segnale che vengono riconosciute da questi sistemi di trasporto. Avevamo visto quello che avviene a livello del nucleo, dove troviamo quei complessi molto grossi che costituiscono il poro nucleare, formato da proteine che formano un anello, una struttura che circonda il poro della membrana da cui si dipartono delle fibrille citoplasmatiche e delle fibrille nucleari. Queste formano delle strutture a forma di canestro che permettono un passaggio veicolato di grosse molecole superiori a 5 kDa; le molecole di peso molecolare inferiore riescono a passare direttamente attraverso la membrana.

Il trasporto veicolato prevede l'utilizzo di proteine dette importine ed esportine, in caso rispettivamente di importo o esporto nucleare. Come funziona questo sistema? Si basa sulla quantità relativa di una proteina che lega o il GDP o il GTP chiamata Ran. Questa Ran GTP è fondamentale per il trasporto dal citoplasma al nucleo e viceversa: infatti, il trasporto da e verso il nucleo segue un gradiente di concentrazione di Ran GTP e Ran GDP, grazie all’attività di 2 enzimi, Ran GAP e Ran GEF, che hanno una specifica localizzazione, la prima esclusivamente citoplasmatica, l'altra nucleare. La Ran GAP, nel citoplasma, idrolizza GTP a GDP, quindi nel citoplasma avremo alti livelli di Ran GDP ma bassi livelli di Ran GTP. Nel nucleo non abbiamo Ran GAP ma abbiamo Ran GEF, uno scambiatore guanilico che va a sostituire GDP con GTP, perciò nel nucleo abbiamo alti livelli di Ran GTP e bassi livelli di Ran GDP. Si ha quindi un movimento secondo gradiente di Ran GTP dal nucleo al citoplasma e un altro movimento secondo gradiente che spinge la Ran GDP dal citoplasma al nucleo. Quindi, sul versante citoplasmatico, le importine permettono l'ingresso nel nucleo, mentre per l'esporto nucleare abbiamo le esportine. Sia le importine che le esportine si legano al complesso della Ran e permetto l’ingresso e l’uscita delle proteine dal nucleo grazie al gradiente di concentrazione. L’esportina, ad esempio, arriva nel citoplasma perche coniugata al Ran GTP, ma nel citoplasma il Ran GTP diventa Ran GDP. Questo permetto il rilascio della proteina e può iniziare un nuovo ciclo. Per quanto riguarda il sistema di localizzazione, ne esistono di specifici anche a livello del mitocondrio, e avevamo visto che la proteina può avere diversi siti di localizzazione a livello mitocondriale, quindi una proteina può arrivare ad associarsi alla membrana mitocondriale esterna o interna, allo spazio intermembrana o alla matrice mitocondriale.

In che modo una proteina arriva in una di queste possibili localizzazioni? Arriva tramite un sistema di proteine traslocatrici o complessi traslocatori chiamati TOM per quanto riguarda la membrana esterna e TIM per quanto riguarda la membrana interna. Ci sono anche altri due complessi: SAM associato alla membrana esterna e OXA associato a quella interna.

Se, ad esempio, una proteina ha come destino la matrice mitocondriale passerà prima tramite il complesso TOM, poi quello TIM e poi verrà rilasciata nella matrice mitocondriale, dove avverrà il taglio del peptide segnale e il folding della proteina. Se invece una proteina deve andare nella membrana esterna passerà tramite i complessi SAM e TOM; è importante che una proteina di questo tipo abbia una sequenza prettamente idrofobica che possa essere inserita nella membrana. Il complesso TOM, infatti, può aprirsi lateralmente e mettere in comunicazione la proteina con la membrana mitocondriale esterna; la proteina risulterà così bloccata sulla membrana. A questo punto intervengono dei complessi molecolari che determinano il folding della proteina, mentre le sequenze segnale verranno contemporaneamente rimosse. Lo stesso discorso vale per la membrana interna e il complesso TIM. Esiste un particolare compartimento all’interno della cellula, il perossisoma. Anche nei perossisomi arriveranno le proteine, tramite delle intrusioni o pezzi di membrana che hanno origine reticolare; dal reticolo, infatti, si staccano pezzi di membrana sotto forma di vescicole che contengono anche un po’ di lume del reticolo che vanno a fondersi con i perossisomi. Il trasporto di queste vescicole avviene tramite delle proteine chiamate PECS (perossine), che mediano il trasporto di pezzi di reticolo a livello del perossisoma.

Il perossisoma è estremamente importante perchè una grossa parte del metabolismo avviene in questi organelli, sia per quanto riguarda cellule animali che vegetali. In tutti i metabolismi in cui si

crea acqua ossigenata, come la beta-ossidazione degli acidi grassi o il ciclo del gliossidato, si ha come prodotto di scarto acqua ossigenata che deve essere degradata, per detossificare la cellula. L'unico organello in grado di farlo è il perossisoma, che contiene vari enzimi connessi con le specie reattive dell'ossigeno, come la catalasi che degrada l’acqua ossigenata e altri perossidi, trasformando i radicali superossido in acqua ossigenata , che viene poi degradata ad acqua più ossigeno. Il perossisoma è importante perchè in tutta una serie di processamenti di alcuni lipidi o fosfolipidi si genera l'acqua ossigenata e quindi il perossisoma svolge quest'azione detossificante eliminando l'acqua ossigenata, che potrebbe bloccare questi processi.

La catalasi utilizza l’H2O2 prodotta in queste reazioni secondo la reazione:

Tutte le proteine destinate al perossisoma hanno una sequenza caratteristica al C-terminale detta SKL (cioè Serina, Lisina e Leucina), e questo trasporto delle proteine verso il perossisoma avviene tramite le perossine in modo ATP dipendente. Ci sono tutta una serie di patologie epigenetiche connesse a difetti perossisomali, come la sindrome di Zellweger, che però porta alla morte poco dopo la nascita, quindi provoca delle anomalie molto gravi. E’ stato visto che questi perossisomi difettosi portano delle mutazioni a livello dei tessuti cerebrali, del rene e del fegato. E’ come se gli individui affetti avessero dei perossisomi vuoti, costituiti solo dalla membrana e con un lume perossisomale poco concentrato. I perossisomi servono a tutta una serie di switch metabolici, originano a livello del reticolo endoplasmatico, in forma di vescicole che poi si fondono a un determinato sito di questi perossisomi che poi si ingrandiscono fino a quando vanno incontro a fissione e divisione, in modo da formare più perossisomi.

Perchè tutte le proteine che arrivano al reticolo, al Golgi, al lisosoma, alla membrana vengono sintetizzate nel reticolo endoplasmatico? Perchè ci sono dei ribosomi adesi al reticolo endoplasmatico? Perchè esistono due localizzazioni diverse per i ribosomi, due siti in cui i ribosomi funzionano e sono in attiva traduzione? Abbiamo ribosomi citoplasmatici e ribosomi adesi al reticolo. Quelli che aderiscono al reticolo lo fanno perchè le proteine che escono dal reticolo devono avere una specifica sequenza segnale che ritroviamo all'N-terminale, che indirizza la cellula verso un determinato compartimento. Questa regione è costituita da uno stretch amminoacidico idrofobico costituito da 15-18 amminoacidi di natura idrofobica.

Lo smistamento delle proteine verso il reticolo endoplasmatico è di tipo co-traduzionale: poichè la sequenza segnale si trova all'N-terminale, una proteina che deve passare nel reticolo può anche iniziare ad essere sintetizzata a livello di un ribosoma libero del citoplasma. La prima porzione della proteina che il ribosoma traduce è la N-terminale, dove troviamo la metionina. Infatti il ribosoma scorre lungo il trascritto alla ricerca dell'AUG, che si posiziona in prossimità del sito P, mentre entra nel sito P un tRNA che porta un anticodone che è complementare ad AUG. Il tRNA porta un amminoacido legato ad esso tramite il gruppo -COOH dell'amminoacido, quindi il gruppo N-terminale di questo amminoacido è libero. La porzione C-terminale del primo amminoacido legato al tRNA, dopo il rilascio del tRNA, si va a legare all'N-terminale del secondo amminoacido, quindi il primo amminoacido avrà il gruppo N-terminale libero. Quindi la prima parte della proteina che viene tradotta è la parte N-terminale.

Lo smistamento della proteina verso il reticolo endoplasmatico avviene per quelle proteine che hanno una determinata sequenza segnale, che si trova all'N-terminale, che è la prima parte della proteina che viene tradotta ed è la prima parte della proteina che viene liberata dal ribosoma, non ancora fisicamente distaccata, ma che fuoriesce dal ribosoma in attiva traduzione. Questa porzione che fuoriesce dal ribosoma può essere legata da degli specifici recettori, chiamati proteine SRP, che troviamo esclusivamente sul reticolo endoplasmatico. Quindi dal ribosoma fuoriesce l'Nterminale, cioè la regione in cui si trova la sequenza segnale delle proteine che sono dirette al reticolo. Questa sequenza segnale viene riconosciuta da uno specifico recettore presente solo sulla superficie del reticolo endoplasmatico: questa proteina si chiama SRP (Signal Recognition Particle).

Il reticolo è costituito da una serie di cisterne e che hanno la stessa natura dell'involucro nucleare. La parte più esterna della membrana nucleare è contigua a quella del reticolo endoplasmatico.

Il reticolo serve per svolgere tutta una serie di funzioni: ad esempio la parte liscia a cui non aderiscono i ribosomi serve da deposito per gli ioni calcio. A livello del reticolo endoplasmatico avvengono anche importanti processi metabolici quali la sintesi dei fosfolipidi, motivo per cui tutte le membrane di origine biologica originano sempre dal reticolo endoplasmatico. Perchè la natura ha evoluto il traffico vescicolare, che permette il movimento delle vescicole dal reticolo a tutta una serie di organelli: perossisoma, lisosoma, Golgi o anche alla membrana plasmatica? Perchè più pezzi di membrana arrivano dal reticolo ai compartimenti o alla membrana, più la membrana tenderà a crescere. Quindi tutti i fosfolipidi che arrivano alla membrana originano sempre nel reticolo, che è la sede della loro sintesi. L'apporto di vescicole ai vari organelli determinerà tra l'altro l'accrescimento dei vari organelli. Oltre alla sintesi dei

fosfolipidi il reticolo è anche implicato nella biosintesi del colesterolo e nel processamento di colesterolo per produrre gli ormoni steroidi. Quindi anche tutti gli ormoni steroidei si originano sempre a partire dal reticolo endoplasmatico. Inoltre svolge anche importanti funzioni di detossificazione, perchè produce tutta una serie di citocromi che svolgono attività antiossidante.

Abbiamo detto che questa porzione delle proteine che fuoriesce dai ribosomi nella sintesi proteica all'N-terminale viene riconosciuta da questa proteina che si chiama sequenza di riconoscimento del segnale (SRP). La porzione N-terminale viene legata dalla proteina SRP. Nel momento in cui l'SRP lega questa sequenza segnale della proteina, la sintesi proteica si blocca. Questa proteina SRP ha a livello del reticolo endoplasmatico un suo recettore, che si chiama recettore dell'SRP, che si trova vicino ad un traslocatore, che si chiama traslocatore del reticolo endoplasmatico o Sec-61. Si tratta di un traslocatore, come TOM e TIM che si trovano nei mitocondri. Sec-61 lo troviamo solo nel reticolo e prossimo al recettore del'SRP. Quindi, a livello della superficie del reticolo endoplasmatico, troviamo sia il recettore dell'SRP sia il traslocatore. Il recettore dell'SRP presenta un sito di aggancio per il complesso costituito dal poliribosoma, dal trascritto e dalle proteine nascenti. Appena SRP si lega alla porzione Nterminale della proteina, la traduzione si arresta e tutto il complesso arriva a livello di questo recettore dell'SRP, che troviamo associato alla membrana del reticolo e in prossimità del traslocatore del reticolo o traslocatore Sec-61. A questo punto l'estremità N-terminale passa dal recettore dell'SRP al traslocatore, così la sintesi proteica riprende, la proteina inizia ad essere sintetizzata e questa sintesi spinge la proteina dentro il reticolo attraverso il traslocatore.

Ora se questa proteina sarà una proteina solubile, quindi non associata a membrana, essa non avrà regioni idrofobiche, ma sarà idrofilica e solubile nel lume del reticolo, che è la parte interna del reticolo. Se quella proteina contiene delle regioni idrofobiche, essa si localizzerà a livello della membrana del reticolo. Questo perchè il traslocatore ha la capacità, come TOM e TIM, di aprirsi lateralmente al passaggio di una regione idrofobica, mettendo in comunicazione tale regione idrofobica della proteina con la membrana del reticolo. Come si dispone questa proteina nascente a livello del reticolo endoplasmatico? Le proteine si disporrano o con la parte N-terminale rivolta verso il lume o con la parte N-terminale rivolta verso l'ambiente citoplasmatico, e quindi ha due possibilità. 1. Se una proteina si dispone con la regione N-terminale verso il lume, quella proteina in qualunque altro organello vada avrà sempre la parte N-terminale rivolta verso il lume. Quando queste proteine migreranno dal reticolo ad esempio verso il Golgi, la proteina si disporrà nella membrana della vescicola trasportatrice e avrà l'N-terminale verso il lume della vescicola. Anche quando raggiungerà il Golgi, la porzione N-terminale si disporrà verso il lume dell’organello. 2. Invece se la proteina ha l'N-terminale rivolto verso il citosol , quella parte sarà, ovunque vada quella proteina, sempre rivolta verso il citosol. Se quella proteina avrà una localizzazione in membrana plasmatica, se nel reticolo era rivolta verso il citosol, anche nella membrana di qualsiasi altro organello sarà rivolta verso il citosol. Infatti una regione che è rivolta verso il citosol, vuole stare rivolta solo verso l'ambiente citoplasmatico, che ha delle caratteristiche e una rara combinazione di elementi, molecole, proteine, acqua che contraddistinguono specificatamente il citoplasma. Il traslocatore ha questa capacità di trasformarsi in una sorta di canale, che, tra l’altro, possiede anche un tappo, cioè una molecola che blocca il canale del traslocatore. Quando il traslocatore si attiva, il tappo si sposta e la proteina passa attraverso il doppio strato lipidico della membrana del reticolo endoplasmatico attraverso questo traslocatore. Quando passa una porzione idrofoba, il traslocatore si apre lateralmente mettendo in comunicazione questa parte idrofobica con il doppio strato idrofobico della membrana. Quando, invece, una proteina raggiunge il lume del reticolo, viene foldata e in concomitanza viene anche tagliato il peptide segnale da quella che si chiama peptidasi del segnale, che ha una localizzazione reticolare. Ovviamente le proteine possono avere una sola porzione transmembrana o più porzioni transmembrana. Sulla base delle porzioni di ogni proteina che passano la membrana, questa si può disporre in un modo o in un altro. Una proteina può disporsi con la regione N-terminale verso il citosol o verso il lume. Questo fatto è determinato dalle regioni della proteina che fiancheggiano la sua porzione idrofobica nel suo passaggio attraverso la membrana. Ad esempio una sequenza di amminoacidi carichi positivamente prima della regione idrofobica fa sì che tutto quello che sta all'N-terminale sia rivolto verso il citosol. Invece se delle regioni cariche negativamente seguono le regioni idrofobiche, tutto ciò che viene dopo la regione idrofobica verrà rivolto verso il lume del reticolo.

Perchè tutte le proteine che devono andare alla membrana, al Golgi, al lisosoma devono passare per il reticolo? Perchè nel reticolo avviene qualcosa di fondamentale, cioè delle modifiche posttraduzionali. Tra queste modifiche fondamentali c'è una N-glicosilazione, che non avviene esclusivamente nel reticolo e prevede due fasi: una prima fase reticolare e una seconda fase che avviene nel Golgi. Quindi la N-glicosilazione inizia nel reticolo e termina nel Golgi. Nel Golgi, invece, esiste un altro tipo di glicosilazione, la O-glicosilazione che avviene solo in questo organello e solo per determinate proteine. Perché si chiama N-glicosilazione? Perchè avviene a livello di quegli amminoacidi che hanno gruppi amminici nella catena laterale, come l'asparagina.

Tutte le asparagine che vengono glicosilate a livello del reticolo si trovano all'interno di una particolare sequenza, detta sequenza consensus, anche detta asparagina X serina (Asn-X-Ser,Thr), in cui troviamo un'asparagina, un amminoacido qualsiasi(X) e poi troviamo una serina o una treonina. Se l'asparagina si trova in una di queste sequenze consensus, molto probabilmente verrà N-glicosilata. Cos’è la N-glicosilazione? E’ l'aggiunta di un determinato numero di zuccheri a livello di questo azoto della catena laterale dell'asparagina: in realtà vengono aggiunti 14 gruppi saccaridici, che sono 9 mannosi, 2 N-acetilglucosammina e 3 glucosi. Quando questa proteina arriverà nel Golgi, questi zuccheri verranno tolti. Il mannosio, ad esempio, gioca un ruolo molto importante, perchè alcuni di questi mannosi subiscono una fosforilazione e il mannosio diventa mannosio-6-fosfato. Tutte le proteine N-glicosilate dove uno dei mannosi è fosforilato al livello del carbonio 6 rappresenta un segnale di localizzazione verso il lisosoma. Il mannosio-6-fosfato verrà riconosciuto da un recettore che farà partire delle vescicole che si dirigeranno verso...