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Practica de la electroforesis...

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TECNOLÓGICO NACIONAL DE MÉXICO INSTITUTO TECNOLÓGICO DE TIJUANA Carrera: Ing. Bioquímica

Asignatura: Bioquímica del nitrógeno y regulación genética

Nombre del docente: M.C Eduardo Méndez Valenzuela

Laboratorio: Electroforesis (Gel de Agarosa)

Nombre de los integrantes: García Melchor Iván Yair (15211238) González Cruz Edith (15211240) Iñiguez López Luz Janeth (15211243) Jaime Esquer Belén Estrella (15212391) Rodríguez Ramírez Bramdom Arturo (16210010) González Cornejo Marla (13211554)

Grupo 5IBQA

OBJETIVO

•

Comprender el procedimiento para la elaboración de geles de agarosa para electroforesis, así como también el uso correcto de la cámara electroforética. INTRODUCCIÓN La mayoría de las biomoléculas poseen una carga eléctrica, cuya

magnitud depende del pH del medio en el que se encuentran. Como consecuencia, se desplazan cuando se ven sometidas a un campo eléctrico. Se denomina electroforesis a la técnica mediante la cual se separan las biomoléculas en disolución cuando se ven sometidas a un campo eléctrico. Se trata de una técnica fundamentalmente analítica, aunque también se puede realizar

con

fines

preparativos.

Cada molécula se desplaza por efecto del campo, alcanzando rápidamente una velocidad constante al equilibrarse la fuerza impulsora (fuerza del campo eléctrico) con la resistencia al avance (fuerza de fricción o rozamiento) impuesta por el medio en el que se desplaza. El coeficiente de fricción mide la resistencia intrínseca debida a las características de cada molécula, siendo éstas esencialmente su forma y su tamaño. Así, por ejemplo, las moléculas grandes y de forma irregular poseen un mayor coeficiente de fricción que las pequeñas y compactas. La velocidad por unidad de campo recibe el nombre de movilidad electroforética. Aunque es menos frecuente, también se puede aplicar la electroforesis para la separación de células. La muestra debe situarse en o sobre un medio soporte, para evitar perturbaciones mecánicas y corrientes de convección durante la separación. En algunos soportes (papel o similares) la muestra queda sobre la superficie y avanza a lo largo de ella, con escasa fricción, por lo que el mecanismo principal de separación es la magnitud de la carga de cada componente de la muestra. Otros medios de soporte (“geles”, medios semisólidos o gelatinosos) están formados por polímeros que forman una malla, matriz o red tridimensional a

través de la cual deben avanzar las moléculas de la muestra, que queda embebida en el medio de soporte electroforético. Como consecuencia, la fricción es notable y los factores de forma y tamaño adquieren una alta relevancia en la separación. Entre los medios de soporte de baja fricción para realizar la electroforesis se encuentran el papel, el cual es sencillo, pero con elevada adsorción debido a los grupos hidroxilo de la celulosa y el acetato de celulosa, donde los grupos – OH están acetilados, lo que reduce la adsorción; baja tinción de fondo; es posible transparentarla o disolverla para detectar y recuperar, respectivamente, los componentes separados. Entre los medios de alta fricción están la poliacrilamida, el gel es el resultado de la polimerización química de una mezcla de acrilamida y bisacrilamida. Regulando la concentración de ambas y su proporción se consiguen distintas porosidades, siempre menores que la de los geles de agarosa, y por último la agarosa, este polisacárido, producto purificado de algas (composición similar al agar-agar). Se disuelve en caliente (50-60°C) y al enfriar solidifica formando un gel, de alta porosidad. MARCO TEÓRICO La electroforesis es una técnica habitual en el laboratorio clínico. Permite separar especies químicas (ácidos nucleicos o proteínas) a lo largo de un campo eléctrico en función de su tamaño y de su carga eléctrica. Los ácidos nucleicos, ADN y ARN, tienen por naturaleza carga negativa. Si ponemos fragmentos del ADN extraído de una muestra biológica sobre un soporte

poroso (gel) y

aplicamos un campo eléctrico, se producirá la migración diferencial de los fragmentos a través de los poros de la matriz. La tinción del gel con bromuro de etidio, que es una sustancia fluorescente que se intercala en la molécula de ADN, y la exposición con luz ultravioleta, permite observar el resultado de ésta migración.

El tamaño de los fragmentos de ADN se puede estimar comparándolos con el patrón de bandas que se obtiene de marcadores comerciales de peso molecular conocido. La electroforesis de ADN es útil para comparar patrones de bandas de diferentes muestras biológicas. Así por ejemplo se puede usar para comparar muestras de individuo sano frente a individuo enfermo, para la identificación de ácidos nucleicos de agentes infecciosos o para la obtención de un fragmento determinado de ADN que, una vez localizado en el gel, puede ser extraído para análisis posteriores. (Medicina molecular, 2007) Electroforesis en gel de agarosa La electroforesis en geles de agarosa es el método estándar para separar y purificar fragmentos de ADN cuando no requerimos un alto poder de resolución. Soluciones y buffers Como buffer de electroforesis y para la preparación del gel puede utilizarse opcionalmente TAE (Tris-Acetato EDTA) o TBE (Tris-Borato EDTA). El TAE tiene una menor capacidad de amortiguación que el TBE, y puede resultar en una acidificación del medio si la electroforesis se desarrolla durante un periodo muy prolongado, pero funciona muy bien con tiempos normales de electroforesis, además tiene una mayor capacidad de resolución que el TBE para tamaños grandes de ADN. Ambos suelen prepararse como soluciones concentradas, que pueden almacenarse a temperatura ambiente (previa esterilización en autoclave), éstas se diluyen con agua antes de cada electroforesis para lograr la concentración de uso: 1x para el TAE y 0.5x para el TBE. (Fierro, F, s.f.)

MATERIALES Y REACTIVOS Unidad de electroforesis horizontal Fuente de poder (0-500 V) •

Micropipetas (10 μL, 100 μL)

•

Bolsa hermética (Tipo Ziploc) Agua destilada.

•

Potenciómetro TAE 5X y 1X EDTA Agarosa

•

Marcador de ADN estándar. Azul de bromofenol. Glicerol

PROCEDIMIENTO

Parte 1: primera sesión

1. Preparar 250 mL de solución amortiguadora TAE 5X.

2. Tomar el molde para formación del gel y colocar las cubiertas de silicona.

3. Determinar cuál es el volumen requerido de gel para el molde que se emplea (en ml).

4. Diluir el volumen necesario de TAE 5X para obtener una solución de concentración de 1X .

5. Disolver la cantidad de agarosa para el volumen determinado de buffer TAE 1X para preparar una solución al 1%.

6. Llevar a ebullición y agitar hasta disolver.

7. Mantener a 50 °C hasta usar o dejar enfriar debajo de esta temperatura y vaciar en el molde.

8. Inmediatamente colocar el molde para los pozos de muestra (peine) a 1 cm de la orilla.

9. No tocar y esperar a que se solidifique el gel (aproximadamente 30 minutos).

10. Retirar los moldes de silicona (o la cinta adhesiva del molde) y almacenar en una bolsa hermética conteniendo 20 mL de Buffer TAE 1X.

11. Rotular fecha y características del gel.

Parte 2: Segunda sesión

1. Colocar el gel elaborado preiamente en el molde acrílico

2. Tranerir a la cámara electroorética colocando los poos del lado del cátodo(-)

3. Preparar 300 mL de solución amortiguadora TAE 1X.

4. Vaciar en la cámara electroforética asta sumergir el gel(ver marcas en la cuba horizontal, 2 mm por encima de la supercicie del gel).

5. Cargar la muestra de ADN(de 5 a 10 micro L).

6. Encender la fuente de poder y correr a 100 V (250-300mA) por 45 minutos a 1 hora.

7. Vigilar el progreso de la electroforesis con el desplazamiento de la banda del colante de rastreo (azul de bromofenol con xilenocianol).

8. Apagar la fuente de poder cuando el colorante haya llegado a 1 cm de la orilla del gel (del lado opuesto a los pozos).

9. Retirar el gel de la cámara y remover del molde.

10. Colocar en la solución de bromuro de etidio y dejar teñir por 15 minutos.

11. Colocar en el transilumnador y analizar la presencia de bandas fluorescentes de color naranja, indicando la presencia de las diferentes fracciones de ADN.

RESULTADOS Colocación de la muestra de ADN en los pocillos con la micropipeta.

Desplazamiento

final

de

la

electroforesis, donde la coloración azul fuerte es la muestra de ADN y el de coloración morada es el marcador.

Adición del bromuro de etidio, el cual proporcionará

el

fluorescencia

para

efecto

de

posteriormente

observar la migración de la muestra.

El color brillante y de menos bandas corresponde a la muestra de ADN, del lado derecho se puede observar un brillo tenue pero con más bandas, el indicador.

ANALISIS DE RESULTADOS Al finalizar la electroforesis se pudieron apreciar las bandas de ADN sobre el gel. Éstas bandas fueron separadas por la diferencia de cargas dentro de la molécula de ADN con la que se contaba al inicio. Al observar el gel bajo luz UV se pudo apreciar la distancia entre la muestra de ADN y su posición inicial, que fueron los pozos sobre el gel. Para poder observarse se empleó el bromuro de etidio, que al ser un indicador facilita la visualización de la muestra de ADN. CUESTIONARIO 1. ¿Cuál es el fundamento de la técnica de electroforesis? La idea de utilizar la técnica de electroforesis a través de una matriz para analizar muestras de ADN corresponde a Vin Thorne, un bioquímico del Instituto de Virología de Glasgow, quien a mediados de los años 60 del pasado siglo estaba interesado en caracterizar las distintas formas de ADN que se obtenían de partículas purificadas de polyomavirus. Su razonamiento era que una combinación de fuerzas eléctricas y de fricción permitiría el desplazamiento y separación en función del tamaño o topología de diferentes moléculas de ADN. (Fierro, F., s.f.) 2. ¿Cuál es el objetivo de utilizar diferentes concentraciones en gel de agarosa? Cuanto más baja es la concentración de agarosa mayor es el tamaño de las moléculas que pueden separarse, y viceversa. (Fierro, F., s.f.) 3. ¿Por qué se añade glicerol a la muestra depositada? Se añade glicerol para aportar densidad a la muestra y facilitar su aplicación a los pocillos. (Biomodel, s.f.) 4. ¿Por qué se añade azul de bromofenol a la muestra depositada?

El azul de bromofenol se utiliza como marcador del frente de avance de la electroforesis. Asimismo, su color es una ayuda visual durante la carga de muestra en los pocillos puesto que su color azul-violeta es bien visible, permite detener la electroforesis con la confianza de que las moléculas de proteína o DNA no se hayan salido del gel. (Biomodel, s.f.) 5. ¿Qué otros tipos de geles pueden preparar? ● Gel de agarosa ● Gel de poliacrilamida ● Gel de campo pulsado (Fierro, F., s.f.) 6. ¿Qué alternativas se pueden utilizar al bromuro de etidio para teñir los geles? Existen alternativas a la tinción con BrEt. El SYBR Gold (nombre comercial) es un colorante muy sensible con una elevada afinidad por el ADN, que puede detectar cantidades de tan sólo 20 pg de ADN. Su elevado precio hace que sólo sea recomendable su uso para la detección de cantidades muy pequeñas de ADN que no sean detectables mediante tinción con BrEt. Otros colorantes disponibles actualmente son el SYBR Green, también de alta sensibilidad, y el SYBR Safe, con una sensibilidad similar al BrEt pero menor capacidad mutagénica. Existen además toda una nueva gama de colorantes con diferentes propiedades para la tinción del ADN; compañías como Invitrogen han desarrollado un buen número de estos colorantes, con diferentes niveles de sensibilidad y destinados a diferentes aplicaciones. (Fierro, F., s.f.)

CONCLUSIONES García Melchor Ivan Yair (15211238): Fue posible la separación de bandas de una muestra de ADN mediante una electroforesis en gel de agarosa. La electroforesis se llevó de forma horizontal a un voltaje de 100 V. Posteriormente se añadió como indicador el bromuro de etidio para poder visualizar la separación de las bandas mediante luz UV, donde se determinó que la electroforesis fue exitosa. Sin embargo, durante la electroforesis la muestra de ADN se había corrido sobre el gel, esto debido a una mala colocación sobre los pozos del gel, donde si no se colocaba la muestra en una buena posición la muestra podía correr debajo del gel o sobre el gel como fue el caso. González Cruz Edith (15211240): Gracias la realización de esta práctica conocimos el procedimiento correcto para elaborar un gel de Agarosa y también a colocar la muestra en los pozos del gel tratando de no romperlo o que la muestra quede esparcida en la superficie del gel. En referencia a las observaciones vimos como la muestra se iba desplazando de un lado negativo a otro positivo, esto debido a la carga negativa que presenta las proteínas en su grupo fosfato. Iñiguez López Luz Janeth (15211243): En base a lo visto en la práctica se puede concluir que la electroforesis es una técnica que nos permite separar biomoléculas en base a su carga, el movimiento es originado por el campo eléctrico. Se pudo observar que la muestra corrió con una forma definida, esto debido a que los pocillos sirven de molde para la observación de los fragmentos. Los fragmentos se pudieron observaren distintos puntos de la corrida, ya que al tener un marcados con muestras de ADN conocido, ayudando a identificar cuales fragmentos están existentes en la muestra, siendo esto de utilidad a la hora de realizar investigaciones. Jaime Esquer Belén Estrella (15212391): Se comprendió el procedimiento para la elaboración de geles de agarosa para electroforesis, así como la importancia que se debe de tener al manejar cada uno de los reactivos; siendo

que si alguno está en exceso todo el proceso puede fallar. También se entendió el uso correcto de la cámara electroforética y todas las aplicaciones que tiene en pruebas de laboratorio. González Cornejo Marla (13211554): Electroforesis es una técnica importante en diversos campos ya que ayuda a comparar patrones de bandas de diferentes muestras biológicas, por ejemplo es utilizada en laboratorios de investigación forense, así como en ciencias afines a la bioquímica como química clínica, criminalística, alimentos, toxicología, farmacología, enzimología, inmunología, microbiología, botánica, citología, etc. Rodriguez Ramirez Brandom (16210010): Se logro comprender como es la electroforesis en gel de agarosa es de las más utilizadas para analizar y caracterizar ácidos nucleicos de distintas procedencias. Los geles se comportan como un tamiz molecular y permiten separar moléculas cargadas en función de su tamaño y forma. REFERENCIAS

•

Anónimo. (s/f). Electroforesis de proteínas y ácidos nucleicos. Consultado el

8

de

noviembre

de

2017.

De:

http://biomodel.uah.es/tecnicas/elfo/inicio.htm

•

Biomodel. (s.f) Reactivos empleados en la electroforesis de DNA y de proteínas. Consultado el día 8 de noviembre de 2017, disponible en la página web: http://biomodel.uah.es/tecnicas/elfo/reactivos/reactivos.htm

•

Fierro, F. (s.f.) Electroforesis de ADN. Consultado el día 8 de noviembre de

2017,

disponible

en

la

página

web:

http://www2.inecc.gob.mx/publicaciones/libros/710/electroforesis.pdf

•

Medicina molecular (2007) Electroforesis en gel. Consultado el día 8 de noviembre

de

2017,

http://medmol.es/tecnicas/68/

disponible

en

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web:...