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PRÁCTICAS MICROBIOLOGÍA CLÍNICA PRÁCTICA 1: INFECCIÓN URINARIA (HEMOCULTIVO Y UROCULTIVO) 1. Introducción: Etapas de un cultivo microbiológico: Fase pre analítica -

Recogida Transporte Procesamiento

Fase analítica -

Lectura diaria del cultivo Identificación y antibiograma

Fase post analítica -

Informe interpretado de resultados Toma de decisiones clínicas

Medios de cultivo: -

Medio general: crecen prácticamente todos los microorganismos. Medio enriquecido: microorganismos con exigencias nutricionales Medio diferencial: se diferencian unos de otros por alguna característica bioquímica, morfológica, metabólica… Medio selectivo: se inhibe el crecimiento de algunos microrganismos y favorece el crecimiento de otros.

Siembra: Recepción: evitar errores administrativos. Comprobar datos del paciente. Procesamiento inicial: en cabina de flujo laminar. Siembra y tinciones. Se coloca vertical sobre la llama hasta la incandescencia. Agotamiento por estrías con un asa de siembra. El objetivo es tener al final de la última estría las colonias lo más separadas posible. Incubación: En estufa de incubación, condiciones constantes: -

Temperatura: 35-37ºC, 42ºC. Oxígeno CO2: 5-10% Humedad pH: neutro

Las colonias tendrán formas y olores característicos. En jarra de anaerobiosis. Atmósfera anaerobia. Un catalizador químico consume el oxígeno dentro de la jarra.

Tinciones: -

Examen en fresco: No se utiliza ningún colorante. Se extiende la muestra entre porta y cubreobjetos. 20x, 40X. Observación directa. Detecta formas móviles. Tinción simple: utiliza un solo colorante. Todas las estructuras se tiñen igual. (Tinción Azul de metileno, Tinta china, KOH, Giemsa) Tinción diferencial: Se utilizan dos o más colorantes sobre la misma muestra. Las estructuras se diferencian según su afinidad a uno y otro colorante, y por tanto de su estructura química. Tinción de Ziehl –Neelsen. Tinción de gram (diferencia una característica: presencia o ausencia de pared celular. Clasifica los microorganismos en Gram positivos y Gram negativos).

2. Caso clínico 1:

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Tipos de infecciones urinarias: -

Infecciones urinarias bajas: cistitis, orquitis, uretritis, prostatitis. Infecciones urinarias de vías altas: uretritis, pielonefritis (riñón). Cursan con dolor en el riñón, fiebre y afectación del estado general.

Diagnóstico: Infección del tracto urinario. Pielonefritis. Fiebre termometrada de 38,7ºC Puño percusión positiva. Se recoge urocultivo y hemocultivo (para detectar diseminación de bacterias a la sangre). Definiciones: DISURIA: Difícil, dolorosa e incompleta expulsión de la orina. POLAQUIURIA: Aumento de la frecuencia de micción. HEMATURIA: Presencia de hematíes en orina. PIURIA: Presencia de leucocitos en orina. PCR EN 7.6 Indicador inflamación / infección. >1 PROCALCITONINA 3.2 Indicador inflamación /infección. >1 Leucocitos elevados con predominio de Neutrófilos 74.8%

a) Urocultivo: orina 3 Se recoge micción intermedia. La boca del frasco no se debe tocar con los dedos o con la ropa. Orinar desechando los primeros 20-25 ml. En niños se recoge mediante una bolsa colectora y se revisa cada 30 minutos para ver si se ha llenado. Si en una hora no se recoge muestra volver a lavar genitales y colocar nueva bolsa. Transferir contenido a un frasco estéril. Descartar muestras con contaminación fecal. Siembra: con asa de calibrado de 1 µL. Índice de Kass: > 105 UFC/mL infección. La orina se siembra en agar cromogénico CPS3. -

Aislamiento y recuento de patógenos urinarios. Agar cromogénico (medio diferencial)

Los patógenos urinarios se diferencian unos de otros por el color que adquiere la colonia en el medio de cultivo: -

Color rojo-vino burdeos: β-glucuronidasa. E. coli Color azul turquesa: β-glucosidasa. Enterococo o Klebsiella Color marrón: desaminasa. Proteus o Organella

Incubación: 24 horas a 37ºC. 3

Tinción gram: FIJACIÓN CON CALOR 1.-CRISTAL VIOLETA 1 minuto. Colorante Primario. ---------------------------LAVAR CON AGUA-------------------------2.-LUGOL 1 minuto. Mordiente. Fija el colorante a la pared celular. ---------------------------LAVAR CON AGUA-------------------------3.-ALCOHOL-ACETONA. 30 Segundos. Decoloración. Paso diferencial. ---------------------------LAVAR CON AGUA-------------------------4.-SAFRANINA 1 minuto. Colorante de contraste. ---------------------------LAVAR CON AGUA--------------------------

b) Hemocultivo: -

Desinfectar con alcohol 70% + clorhexidina Pinchar y extraer 10ml de sangre. Añadir 5ml a cada frasco. o Frasco aerobio: 5ml o Frasco anaerobio 5ml FRASCOS El color indica una condición distinta: Aerobios/Anaerobios. El fondo del frasco tiene un INDICADOR DE PH. CAMBIO DE COLOR CUANDO AUMENTA EL CO2. Se incuba en una estufa especial (BAC-ALERT).

Siembra en Agar Sangre: “Agar Columbia + 5% Sangre” -

Medio general muy nutritivo para el aislamiento de la mayor parte de microorganismos incluidos algunos exigentes. Hemólisis: o alfa: parcial. Verde (biliverdina) o beta: total. Transparente o gamma: ausencia de hemólisis.

Tinción gram (Igual que urocultivo)

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PRÁCTICA 2: PRUEBAS BIOQUÍMICAS Y ANTIBIOGRAMA (CONTINUACIÓN PRÁCTICA 1). CASO CLÍNICO 2: INFECCCIÓN GASTROINTESTINAL. COPROCULTIVO.

1. Interpretación de los resultados del día anterior: Agar cromogénico CPS3: (se realizarán posteriormente las pruebas bioquímicas) -

Siembra: Asa 1μl Nº de colonias en 1 μl

Recuento: Para pasar a UFC/ml multiplicamos el UFC/placa en el CPS por 1000. Si son incontables: considerar 200 UFC/placa. CRITERIO DE KASS: 100.000 UFC/ml. Color de las colonias. Agar sangre: (se realizará una tinción de gram y un antibiograma) Hemólisis de las colonias. Forma de las colonias.

2. Pruebas bioquímicas:

a) Prueba de la oxidasa: detecta sistema citocromo C oxidasa. Es el último componente de la CTE que transfiere electrones al oxígeno. Que reactivo usamos: Dihidrocloruro de fenilendiamina o Aceptor artificial de electrones. o Estado reducido: incoloro o Estado oxidado: AZUL DE INDOFENOL. (azul oscuro)

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b) Prueba del Indol: detecta triptofanasa. Hidroliza y desamina el triptófano. Libera amonio, piruvato e INDOL. El medio utilizado es un caldo rico en triptófano, en el que se suspende una colonia. Tras 24 horas de incubación se usa el reactivo de KOVACS, que al combinarse con el grupo Indol forma un compuesto rojo

c) Prueba de la urea: detecta actividad ureasa. Hidroliza la urea liberando amoniaco y dióxido de carbono. El medio utilizado es Agar Urea de Christensen (es un medio suplementado con urea). Se siembra sobre la superficie del slant. Contiene un indicador de ph: rojo fenol. La urea origina un pH alcalino y el indicador vira a rojo/fucsia. (El amonio alcaliniza el medio). Ventaja selectiva en medios ácidos (H. pylori)

d) Crecimiento a 42ºC: detecta la capacidad de crecimiento a 42ºC. Medio utilizado: infusión cerebro-corazón (BHI). Medio enriquecido con gran cantidad de nitrógeno, carbono y vitaminas. Se suspende una colonia y se incuba un caldo a 37ºC (control) y otro a 42ºC. Si hay turbidez en el medio es que hay crecimiento.

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3. Antibiograma: La actividad in vitro puede no ser la misma que in vivo, por difusión a tejidos, unión a proteínas plasmáticas, interacciones farmacológicas… Escala McFarland: (ácido sulfúrico y cloruro de bario en concentraciones ascendentes progresivas) Se crea una correlación entre la precipitación química y la suspensión bacteriana. Disolver una sola colonia en el suero fisiológico. 0.5 MCFARLAND = 1.5·109 UFC/ml (poco turbio). Es una escala de turbidez. Agar Mueller-Hinton: Medio adecuado para antibiogramas. Siembra en todas las direcciones del espacio (césped bacteriano). Cultivo 24h a 37ºC. o Alta reproducibilidad o Bajo contenido en sustancias inhibidoras o Adecuado crecimiento de casi todos los patógenos a) Disco-Placa o Kirby-Bauer: durante la incubación el antibiótico difunde desde el disco hacia el agar. Se genera un halo de inhibición. Para interpretar los resultados hay que medir el diámetro de cada halo en mm. Se utilizaron los antibióticos: tobramicina (TM), colistina (CL), cefalotina (KF) y norfloxacino (NOR). b) Epsilómetro o E-TEST: Tira fina impregnada de antibiótico. Genera un gradiente continuo y exponencial de concentraciones de antibiótico. Permite detectar la CMI (concentración mínima inhibitoria): Mínima concentración de antibiótico que inhibe el crecimiento del microorganismo. Tras la incubación se observa una elipse de inhibición de crecimiento. El punto de intersección da la “concentración inhibitoria” (CMI) en μg/ml. Se utilizó el antibiótico cloranfenicol. Tinción gram (De una colonia) 4. Caso clínico 2: Paciente de 2 años y 3 meses que acude a consulta por presentar desde ayer por la tarde incremento de la frecuencia deposicional. Ayer realizó 13 deposiciones y hoy lleva 5, de consistencia líquida. Vómitos desde hace 24horas, inicialmente alimentarios y desde esta noche biliosos, que han disminuido progresivamente. Ingesta líquida con buena tolerancia, pero no tolerancia de dieta sólida. Fiebre de 24 horas de evolución de 38,9º axilar como máximo con buena respuesta a antitérmicos y medidas físicas. Buen descanso nocturno. Micción algo más escasa. Sospecha: infección gastrointestinal. Gastroenteritis: puede estar causada por bacterias, virus o protozoos.

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Patología frecuente: es una de las enfermedades infecciosas más frecuentes sólo superadas por las infecciones del tracto respiratorio. Síntomas: fiebre, dolor abdominal, vómitos, diarrea moderada-intensa (acuosa, mucosa, sanguinolenta…) importante diferenciar de cara al diagnóstico. Microbiota entérica: -

ANAEROBIOS(99%): Bacteriodes, Clostridium. Peptostreptococcus Enterobacterias (1%): E.coli, Klebsiella, Proteus.

Agentes bacterianos infecciosos: -

Mecanismo invasor: invaden mucosa y producen diarrea sanguinolienta. Salmonella, Shigella, Yersinia, Campylobacter, E.coli enteroinvasivo. Mecanismo toxigénico: producción de toxinas que actúan sobre la mucosa intestinal. Clostridium difficile, Vibrio cholerae, S.aureus, E.coli enterotoxigénico.

Vías de transmisión: Agua o alimentos contaminados, Transmisión Fecal-Oral, Infección relacionada con viajeros, Brotes Nosocomiales. Mecanismos de patogenicidad primarios: -

Alteración balance agua-electrolitos: secreción masiva de fluidos. Causado por enterotoxinas. Clostridium difficile, Vibrio cholerae, E.coli enterotoxigénico. Destrucción celular, respuesta inflamatoria e invasión enterocitos: disminuye la capacidad de absorción. Causado por citotoxinas. Shigella. Invasión de mucosa intestinal: diseminación a ganglios linfáticos, sistémica. No toxinas.

Tipos de diarrea: -

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Diarrea acuosa: o Aumenta el número de deposiciones o Afectación del intestino delgado donde se absorben el 90% de los nutrientes Diarrea invasiva: o Aumenta el número de deposiciones, pero de menor volumen y con sangre, moco y pus. o Fiebre, dolor abdominal y tenesmo. o Afecta al colon (por lo que disminuye la absorción) o Afectación de mucosa por invasión o producción de citotoxinas.

a) Coprocultivo: cultivo de heces para aislar el microorganismo responsable del proceso diarréico. - Frasco estéril: siembra inmediata (2h). - Medio de transporte (Amies): conservación a 4ºC. Agar MacConkey: Medio selectivo y diferencial recomendado para el cultivo y aislamiento de microorganismos Gram negativos. o Medio selectivo: cristal violeta y sales biliares: sólo crecen bacilos gram negativos. 8

Medio diferencial: diferencia entre fermentadores (rosa) y no fermentadores de la lactosa (transparente). Enterobacterias regionales normales: lactosa generalmente positiva Enterobacterias patógenas: negativo o

Agar Salmonella-Shigella: o Medio selectivo: verde brillante y sales biliares. Inhibe la mayoría de los bacilos gram negativos, coliformes y el swarming de proteus. o Medio diferencial: verde brillante y rojo neutro. Diferencia entre fermentadores y no fermentadores de la lactosa. Si se produce citrato férrico y tiosulfato de sodio (negro): productores de sulfídrico. Enterobacterias regionales normales: lactosa generalmente positiva y sulfídrico generalmente negativo Salmonella: lactosa negativo y sulfídrico positico Shigella: lactosa negativo y sulfídrico negativo. Agar sangre: detecta hemólisis. Indica el estado de la flora intestinal.

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PRÁCTICA 3: IDENTIFICACIÓN DEL MICROORGANISMO CASO 1. (LECTURA PRUEBAS BIOQUÍMCAS Y ANTIBIOGRAMA). CONTINUACIÓN CASO 2 (PRUEBAS BIOQUÍMICAS). CASO CLÍNICO 3: CULTIVO DE ESPUTO. 1. Identificación del microorganismo (caso 1): a) E. coli: es una enterobacteria de la microbiota fecal. 70% de las infecciones urinarias en pacientes sin factores de riesgo no hospitalizados. -

GRAM: Bacilos Gram Negativo OXIDASA: Negativo (ENTEROBACTERIA) AGAR SANGRE: Mucosas grises Gamma-hemolíticas. AGAR CPS :Rojo Vino Burdeos (Beta-Glucuronidasa+) INDOL: Positivo (Triptofanasa+) UREA: Negativo (Ureasa-)

b) Proteus mirabilis: es una enterobacteria de la microbiota fecal. 3ª causa de infección urinaria después de E.coli y Klebsiella spp. Movimiento muy característico en el agar. Swarming. -

GRAM: Bacilos Gram Negativo OXIDASA: Negativo (ENTEROBACTERIA) AGAR SANGRE: Olor intenso. Swarming (velo) AGAR CPS: Marrón (Desaminasa+) INDOL: Negativo (Triptofanasa-) UREA: Positivo (Ureasa+)

c) Pseudomonas aeruginosa: patógeno oportunista. En ingles y axilas y fosas nasales. Infección urinaria en pacientes ingresados o inmunosuprimidos. Muy virulento y resistente. -

GRAM: Bacilos Gram Negativos OXIDASA: Positivo (NO ENTEROBACTERIA) AGAR SANGRE: Brillo metálico. Beta-hemólisis. Olor a perfume o jabón. AGAR CPS: Marrón-verdoso. Pigmentación propia verdosa: Piocianina CRECIMIENTO A 42ºC: Positivo

2. Lectura del antibiograma:

3. Continuación caso clínico 2:

Agar Salmonella-Shigella: Salmonella: -

Lactosa: negativo. Colonias transparentes amarillentas. Sulfídrico: positivo. Precipitado negro en la superficie.

a) Pruebas bioquímicas o Fermentación de la Lactosa o Fermentación de la Glucosa o Producción de gas o Producción de H2S o Actividad UREASA KIA: Agar TSI o Agar con Hierro de Kligger. Compuesto por 10 g de lactosa, 1 g de glucosa, 15 g de peptona, rojo fenol, citrato férrico y tiosulfato de sodio. Identifica la fermentación de la lactosa, la fermentación de la glucosa, la producción de gas y la producción de sulfídrico. Tomar una colonia bien aislada a partir del AGAR SS. Inocular los tubos inicialmente por picadura en el fondo del tubo (de 3 a 5 mm) y posteriormente por estría en la superficie. Incubar los tubos con las tapas flojas a 35-37°C durante 24 horas para que entre oxígeno. -

Fermentación de la glucosa: en la base del tubo A: ácido, fermentación, amarillo K: alcalino, no fermentación, rojo

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Fermentación de la lactosa:

A: ácido, fermentación, amarillo K: alcalino, no fermentación, rojo

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Producción de H2S: formación de un precipitado negro que indica la producción de sulfuro de hidrógeno. Siempre en medio ácido. (si H2S positivo, glucosa positiva)

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Producción de gas: presencia de burbujas o fracturas que indican la producción de gas.

Nomenclatura:

Prueba de la urea: detecta actividad ureasa. (Ya explicada)

b) Serotipificación: o Antígeno O o Antígeno H 4. Caso clínico 3: 12

Varón de 75 años de edad, que ingresa en el Hospital con una historia de dos días de disnea y tos productiva con expectoración blanca. Al examen físico presentaba fiebre de 39ºC, pulso de 120 latidos/minuto, y una frecuencia respiratoria de 20/min. La auscultación del tórax presentó crepitantes bilaterales. La radiografía de tórax presentó infiltrados pulmonares difusos y bilaterales. El recuento de leucocitos era de 10.700/mm3. Tenía una pO2 de 38 mm de Hg que fue corregida mediante oxigenoterapia. La tinción de Gram de un esputo presentó abundantes leucocitos y bacterias. ¿Cuál es la PATOLOGÍA que presentó este paciente en el momento de ingresar en el Hospital? Cuadro respiratorio: Tos, Expectoración, Disnea: Dificultad respiratoria que se traduce en falta de aire. Probable neumonía: Fiebre, Taquicardia, Crepitantes: Sonido burbujeante por la presencia de secreciones en alvéolos, infiltrados pulmonares: Alveolos ocupados por sangre o pus, Leucocitosis, Presión parcial de oxígeno baja (No oxigena bien). Infecciones del tracto respiratorio: -

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Superior: fosas nasales, faringe, laringe. El tracto superior no es estéril. Colonizado por la microbiota orofaríngea: Estreptococos alfa-hemolíticos, Neisseria spp, Anaerobios, Estafilococos coagulasa negativos Inferior: tranquea, bronquios, bronquiolos, alveolos.

Tipos de neumonía: -

Típica: inicio brusco, fiebre elevada, tos productiva, dolor pleurítico (costal), neumonía lobar. Causada por S. pneumoniae. Atípica: inicio progresivo, fiebre no tan elevada, tos seca, típica de jóvenes, neumonía intersticial, más difusa en radiografía. Causado por Mycoplasma, Chlamydophila… Nosocomial Adquirida en la comunidad.

¿Qué Microrganismos podrían causar esta patología? -

Streptococcus pneumoniae Haemophilus influenzae Moraxella catharralis Bacilos gram negativos (Pseudomonas, E. coli, etc) Staphylococcus aureus Legionella pneumophila

Toma de muestra: esputo Procedente del tracto respiratorio inferior: -

Expectoración espontánea o inducida (aerosoles) Contaminación con la microbiota orofaríngea

Importante: tinción de gram: 13

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Células epiteliales: indicación de contaminación orofaríngea Leucocitos: indicador de infección respiratoria. Hematíes

La presencia de bacterias en el gram no es indicativo de infección. Pueden ser parte de la microbiota orofaríngea.

¿Qué muestras respiratorias se podrían haber obtenido para el aislamiento del microorganismo? -

Esputo Lavado broncoalveolar Aspirado nasofaríngeo Aspirado bronquial Cepillado bronquial Punción transparietal (biopsia)

Para el aislamiento de bacterias anaerobias se pueden utilizar aquellas muestras obtenidas con jeringa: punciones o biopsias pulmonares. Sería conveniente recoger también muestras no respiratorias como: -

Hemocultivos: descartar bacteriemia Orina: antígenos de Legionella y neumococo.

a) Cultivos Agar chocolate: Medio general y enriquecido Permite el aislamiento de la mayor parte de microorganismos además de algunos microorganismos nutricionalmente exigentes: Haemophilus y Neisseria. Igual que el Agar Sangre. Sometido a elevada temperatura para lisar parcialmente los hematíes y que liberen los factores de crecimiento: -

Factor V (NAD): dinucleótido de adenina. Termosensible Factor X (hemo): grupo hemo de la hemoglobina. Termoestable.

Agar sangre: el patrón de hemólisis y de morfología van a ser indicativos.

b) Tinciones: Tinción de Kinyoun: coloración en frío 1.-CARBOXIFUCINA 5 minutos. Colorante primario + mordiente. LAVAR CON AGUA 2.-HCL al 3% y etanol. Hasta que se pierda color. Decoloración mas débil que en el ZN. LAVAR CON AGUA 3.-AZUL DE METILENO 1 minuto. Colorante de contraste Tinción de Ziehl-Neelsen: coloración en caliente. 14

1.-Carboxifucina. Colorante 1º + mordiente LAVAR CON AGUA 2.-Aplicar calor debajo del porta hasta la emisión de vapores. 5 minutos. La pared lipídica se ablanda y el colorante penetra mejor. LAVAR CON AGUA 3.-Decolorarcon ácido sulfúrico al 3% y etanol LAVAR CON AGUA 4.-Azul de metileno 1 minuto. Colorante de contra...