Prob Bi GM-BT 20-21 Soluciones Razonadas- Parcial 1 PDF

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ejerecicos...

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PROBLEMAS DE BIOLOGÍA Y GENÉTICA MOLECULAR Grado en Biotecnología Curso 2020-2021 Esquema 1: Acontecimientos claves en Biología Molecular BM Clásica 1869 Miescher

AANN a partir de linfocitos y neutrófilos (pus)

https://ahombrosdegigantescienciaytecnologia.wordpress.com/2015/08/26/eldescubridor-y-la-primera-persona-en-aislar-el-adn-miescher-2/ 1928 Griffith

Principio transformante (Problema 1)

1930 Levine

Identifica ACGT, propone que forman un solenoide (muelle). Hipótesis del tetranucleótido como algo no relacionado con información genética

1944 Avery y col. 1945 Chargaf

Fraccionamiento principio transformante (DNA) Cuantificación de las bases

1952 Hershey & Chase

DNA como portador (Problema 2)

1953 Watson & Crick

Estructura DNA (mecanismo replicación)

1955

Cél somáticas contienen doble de DNA que germinales

1958 Melsenson & Stahl

Replicación semi-conservativa (Problema 3)

1955 Crick

Hipótesis del adaptador (tRNA)

1961 Jacob y Monod

Papel del mRNA y de los operones procariotas

1965 Ochoa (y otros)

Final código genético. Ochoa: polinucleótido fosforilasa (PNPasa, procesamiento y degradación mRNA)

BM Actual 1975

Enzimas de restricción = técnicas secuenciación DNA y clonación

1982 Brinster

Ratón transgénico (hormona crecimiento)

2001

Sec. genoma humano

1.- En 1944 MacLeod and McCarty dieron un paso importante en la identificación del DNA como principio transformante; para ello, se basaron en el experimento de Griffith (figura 1). RUGOSE (R) NO PATÓGENA

A

SMOOTH (S) PATÓGENA Oligosacáridos en cubierta como escape de los macrófagos)

1

C

3

B

2

D

4

Figura 1: Experimento de Griffith, 1928 Prepararon un homogenado de células de Pneumococo de la cepa S ( smooth) muertas por calor, digirieron con proteasas y nucleasas (DNasaI y ribonucleasa) y posteriormente comprobaron su capacidad transformadora añadiéndolas a células de la cepa R (rugose). Sólo la digestión con DNasa anuló la capacidad transformadora del homogénado. La conclusión parecía clara (el principio transformante es DNA) pero el resultado no se aceptó unánimemente por la comunidad científica: se dudó de la eficacia y de la pureza de los enzimas utilizados para la digestión del componente proteico y se argumentó que cantidades residuales de proteína (concretamente un 0.02% de la proteína inicial) presentes en la muestra tratada con proteasas podían ser las responsables de la transformación. Es decir, se seguía creyendo en la hipótesis del tetranucleótido, que afirmaba que los ácidos nucleicos son repeticiones de 4 nucleótidos monótonas, sin ningún sentido. En su lugar, pensaban que las proteínas, con 20 aa naturales, eran las portadoras de la información genética. a) ¿Cuántas moléculas de proteína habría en 1 mL de muestra tratada con proteasas a una concentración inicial de 10-4 g/mL? Mw = 350 res x 110Da/1 res = 38,500 Da 1 mL disol x 10-4 g/1 mL x 1 mol/38,500 g x 1 g/10 6 g x 6.022 x 1023 molec / 1 mol = 1.56 x 109 moléc iniciales 1.56 x 109 moléc iniciales x 0.02 moléculas finales /100 moléc iniciales = 3.12x105 moléc.

b) El argumento de que las proteínas residuales del homogenado podrían ser las responsables de la transformación, ¿te parece válido en aquella época? No, ya que: Extracto + DNasa perdía la capacidad transformante (Obvio) Extracto + proteasas no perdía la capacidad transformante (atribuído a restos de proteína) c) Y, ¿hoy en día? Hoy en día es más que evidente, aunque en los años 80 el descubrimiento de la naturaleza infecciosa de los priones (proteínas) hizo dudar. Además, Avery y col. calentaban la muestra, y las proteínas se desnaturalizan y pierden su función (no se supo hasta los años 60). NOTA: Considera que las proteínas tienen una longitud promedio de 350 residuos de aa y que 110 daltons es la masa molecular promedio de un aa. 2.- Hershey & Chase utilizaron muestras de fago T2, marcado con 32P y 35 S, para infectar cultivos de E. coli. Interrumpieron la infección mediante agitación con una batidora y, después de centrifugar el cultivo, determinaron que más del 80% del 32P (y menos del 20% del 35 S) se encontraba en el sedimento de células (pellet). La lógica experimental demostraba que el componente del fago inyectado o transmitido a la bacteria durante la infección era el DNA. a) Por qué más del 80, y no el 100% de 32P se encontraba en el pellet? No todos los fagos infectaron y quedaron en el sobrenadante b) Por qué detectaron algo de 35S en pellet? Prot. cápside unidas que no se soltaron con la batidora (más del 80% sí) c) En la progenie apareció 30% de 32P, mientras que el % de 35S fue menor del 1%. ¿Qué indicaba este hecho? El DNA inyectado por los fagos se conserva, las prot. son nuevas. d) ¿Cómo realizarías el marcaje? Infectando a E.coli en Medio Mínimo (MM) suplementado con 32 ATP y 35S-Cys (o Met), haciendo varios pases, y usando el lisado fina (sobrenadante después de centrifugar).

Figura 2: Experimento de Hershey & Chase (“de la batidora”), 1952.

3.- En la Figura 3 se muestra el experimento que demostró que la replicación es semiconservativa. Para ello utilizaron E.coli, que se divide en condiciones óptimas cada 20 min.

Figura 3: Experimento Melsenson & Stahl, 1958.

de

En primer lugar, crecieron en MM suplementado que contenía 15NH4Cl durante 15 generaciones. a) Calcula la cantidad de marcaje tras 15 generaciones. 215 = 32768 cadenas ss DNA 15N 1 ds DNA 14N/ 16384 dsDNA 15N. El 14N no se detecta b) Cuanto tiempo esperarías para aislar el DNA desde que inoculas el cultivo para obtener 15 generaciones? 15 gener. X 20 min / 1 gener = 300 min (~ 5h) c) Una vez tenemos 15 generaciones marcadas, centrifugamos y transferimos a un medio no marcado (Figura 3). Después de 60 min, ¿cuál es la proporción de moléculas de dsDNA que contendrán una densidad media? 1/4 d) ¿Cómo demostrarías que el DNA tiene 2 cadenas? Calentando en t = 1 generación antes de ultracentrifugar daría 1 banda 14N y 1 15N 4.- La tabla muestra la composición de bases (en porcentaje de moles) de los ácidos nucleicos de dos bacteriófagos (A y B). Composición de bases % Bacteriófago

A

G

C

T

1

24

26

18

32

2

22

28

28

22

Se deduce directamente de la tabla Además, sabes que: a)

La densidad del DNA-1 en gradientes de CsCl es superior a la del DNA-2. dsDNA ssDNA (RNA)

b)

Las disoluciones del DNA-1 son menos viscosas que las del DNA-2. La viscosidad describe la fricción interna de un fluido en movimiento. Un fluido con gran viscosidad resiste el movimiento porque su composición molecular le da mucha fricción interna. Un fluido con baja viscosidad fluye fácilmente porque su composición molecular produce muy poca fricción cuando está en movimiento. dsDNA más viscoso que ssDNA

c)

La absorbancia a 260 nm del DNA-2 aumenta cuando éste se calienta o expone a valores de pH inferiores a 2 o superiores a 12, mientras que prácticamente no lo hace con el DNA-1. DNA máximo 260 nm, mínimo 230 nm Efecto hipercrómico: ssDNA absorbe más que dsDNA. Al desnaturalizar un dsDNA pasa a ssDNA y aumenta su absorbancia, un % (30-40%) dep de sp (secuencia).

En el caso de proteínas (para problema 5):

Ley de Lambert-Beer AbsXnm =  Xnm c d DOXnm =  Xnm c %CG,  efecto hipercrómico

e.peptidico máx. 214 nm = péptidos Trp > Tyr > Phe (aa aromáticos) máx a 280 nm= proteínas

214

A partir de estos datos, qué puedes deducir sobre el genoma o molécula de DNA de los fagos 1 y 2. Razona la respuesta.

5.- Se ha realizado una miniprep para purificar DNA genómico de E. coli. El volumen final de preparación es de 250 μl. Una dilución 1/20 da los siguientes valores de absorbancia: Abs260=0.38; Abs280=0.23 y Abs230=0.20 ¿Qué cantidad de DNA has obtenido y cuál es su calidad? 20 x 0.38 UAbs x (50 g/mL /1/UAbs) = 380 g/mL 380 g/mL x 0.25 mL = 95 g Abs 260/280 = 0.38 UAbs/0.23 UAbs = 1.65 < 1.8  restos prot. o fenol (denominador demasiado grande). Valores > 1.8 implicarían la presencia de algo que absorbe mucho a 260 nm (RNA, ss) Abs 260/230 = 0.38 UAbs/0.20 UAbs = 1.9 < 2.2 restos prot. (denominador demasiado grande a 230 nm, donde absorben prot (e.peptídico) pero no fenol) Conclusión: hay que desproteinizar NOTA: Las medidas de absorbancia a 260, 280 y 230 nm son útiles para cuantificar preparaciones de ácidos nucleicos y determinar su calidad (pureza). Medida en una cubeta de 1 cm de paso de luz, una disolución de DNA de doble cadena (dsDNA) a una concentración de 50 g/mL da 1 unidad de absorbancia a 260 nm (UA 260); para DNA de cadena sencilla (ssDNA), 1 UA260 equivale a 33 g/mL. En muestras puras de DNA la relación A260/A280 es de aprox. 1.8; valores superiores indican presencia de RNA y valores inferiores indican contaminación de fenol y/o proteína. Otra relación utilizada a menudo es A260/A230: si la preparación de DNA está bien desproteinitzada, debería ser  2.2. Fijaros que para tener 1 UAbs260 nm hace falta mayor cantidad de DNA que de RNA (ss); debido a efecto hipercrómico 6.- Mediante un medidor de mapas se determina la longitud de una molécula de un DNA plasmídico en una micrografía electrónica. La longitud es de 100 mm. La foto se ha hecho en 10.000 aumentos y se ha ampliado 10 veces antes de realizar la medida. Calcula la masa molecular, el número de pares de bases (pb) y el número de picogramos (pg) de DNA que tiene esta molécula. NOTA: Masa molecular de 1 pb.2Na+ = 660 Da. 100 mm x 105 = 10-3 mm = 1 m = 104Å 104Å x 1 pb/3.4Å = 2941 pb 2941 pb x 660 Da/1 pb = 1.94 x 106 Da 1.94 x 106g/1 mol x 1 mol/ 6.022 x 1023 moléc.x 1012 pg/1g= 3.2 x 106 pg Otra manera: 1.94 x 106 Da x 1.66 x 10-12 pg/1 Da = 3.2 x 106 pg Nota. 1.66 x 10-12 pg = (1/NA) x 1012 pg/1 g

7.- Por viscoelasticidad se determinó que un cromosoma de ratón contenía 12 cm de DNA doble cadena. ¿Cuántos pares de bases, picogramos y Dalton (Da) de DNA contiene este cromosoma? 12 cm x 108Å/1 cm = 1.2 x 109Å (105 veces más grande que un plásmido) 1.2 x 109Å x 1 pb/3.4Å = 3.5 x 108 pb 3.5 x 108 pb x 660 Da/1pb = 2.3 x 1011 Da 2.3 x 1011 g/1 mol x 1 mol/ 6.022 x 1023 moléc.x 1012 pg/1g= 0.38 pg 8.- El bacteriófago T2 tiene un DNA de 120 x 106 Da contenido en una cápside de 210 nm de diámetro. Calcula la longitud del DNA y compáralo con la longitud de la cabeza del T2. 120 x 106 Da x 1pb/660 Da = 1.82 x 105 pb (102 más grande que plásmido; 103 más pequeño que cromosoma ratón) (~ 182 kb, muy grande,  50 kb) x 3.4Å/1 pb x 1 nm/104Å = 6.18 x 104 nm 6.18 x 104 nm / 210 nm = 300 veces más largo DNA que cápside

9.- Secuenciación de DNA por el método de Sanger (Didesoxi). Dispones de una muestra de DNA con la secuencia 5'-CAGATTACAGGAACGCCATTAGATA-3'. Incubas alícuotas de este DNA con DNA polimerasa, DNA cebador de secuencia 5'-TATC-3' marcado con fluorescencia y una mezcla diversos desoxinucleósidos trifosfato (los didesoxinucleósidos trifosfato, ddNTP, siempre se añadieron en cantidades relativamente pequeñas). Tras la reacción, separas por electroforesis los productos resultantes y visualizas las bandas por fluorescencia. Dibuja el perfil de bandas obtenido con a) La secuenciación completa de la secuencia si hubieras incluido los dNTPs y los ddNTPs adecuados 5'-CAGATTACAGGAACGCCATTAGATA-3' 3’-GTCTAATGTCCTTGCGGTAATCTAT-5’ 21

ddTT P

1CEBADOR

ddAT P

ddGT P

ddCT P

-21 -20 -19 -18 -17

-16 -15 -14 -13 -12 -11 -10 - 9 - 8 - 7 - 6 - 5 - 4 - 3 - 2 - 1 - C

- C

- C

- C

El cebador es pequeño (4 nt), y la reacción consiste en la síntesis a partir del cebador, que se va parando con los ddNTPs Se lee el gel de abajo a arriba (5’3’) y a la secuencia leída hay que hacerle la complementaria y la reversa b) Cada una de las cuatro mezclas de nucleótidos siguientes: 1. dATP, dTTP, dCTP, dGTP, ddTTP Primer carril 2. dATP, dTTP, dCTP, dGTP, ddGTP Tercer carril 3. dATP, dCTP, dGTP, ddGTP banda cebador 4. dATP, dTTP, dCTP, dGTP banda 21 10.- Proteínas reguladoras. (a) Describe una técnica que permita identificar potenciales proteínas reguladoras de unión a un fragmento de DNA específico, a partir de una mezcla de proteínas de un extracto celular. (b) ¿Qué técnica utilizarías para identificar la región específica de unión al DNA de una proteína reguladora concreta? Ver archivo pdf 11.- Una molécula relajada de DNA circular covalentemente cerrada contiene 756 pares de bases. a) ¿Cuál es su número de enlace topológico (Lo)? L0 = T = 756pb/10.5pb/vuelta = 72 vueltas

b) ¿Cómo variarán su número de torsión (W) y el número de enlace (L) si el número de vueltas de la doble hélice o número de giro (T) disminuye dos unidades debido a una desnaturalización local? L = T+W 0 = -2 +W; W = +2; W = 2 2 vueltas de superhélice levógira 12.- En un DNA superenrollado, un segmento de unos 20 pares de bases pasa de la forma B a la forma Z. ¿Cómo varían los valores de L, T y W? En conformación B: LB = (20pb / 10 pb/vuelta) + WB En conformación Z: LZ = (20pb / -12 pb/vuelta) + WZ LB = LZ; 2 + WB = -1.7 + WZ; W = WZ - WB =3.7 vueltas de superhélice levógira que se han formado, o de hélice dextrógira que se han deshecho (o una combinación). Para saber el valor final de W, deberíamos de conocer el inicial. 13.- Tienes un plásmido de 5.000 pb, lo tratas con topoisomerasa IA a distintos tiempos y analizas por electroforesis de agarosa. Nota: la TopoIA sólo reconoce superenrollamientos negativos. 1. Plásmido linearizado

4. Plásmido + TopoIA a tiempo largo 12345

2. Plásmido inicial

5. Plásmido relajado.

3. Plásmido + TopoIA a tiempo corto a) Determina L0 L0 = 5000pb / 10 pb/vuelta = 500 b) Qué valor de superenrollamiento tiene la molécula intacta -9 c) Determina L para el plásmido intacto L = 500 -9 = 491 d) ¿En qué momento has de añadir el EtBr? Después de que haya corrido el gel para no interferir en el movimiento de los distintos confórmeros 14.- El bacteriófago  infecta E. coli integrándose en el DNA cromosómico bacteriano. El éxito de esta integración depende de la topología del DNA de E. coli. Cuando la densidad superhelicoidal ( ) de E. coli es mayor que -0.045, la probabilidad de integración es 20%; cuando  es menor que -0.060, la probabilidad de la integración es 70%. Se determinó que el DNA aislado de un cultivo de E. coli tiene una longitud de 4x106 pb y un L de 3.72 x105. Calcula  para este DNA y predice la probabilidad con la que el bacteriófago  podría infectar este cultivo. I-------------------------I------------I------------I---------------------------------------------------------

p>70% -0.060

-0.045

0 p70%

15.- Para estudiar las propiedades del factor σ de la RNA polimerasa (RNAP) de E. coli se realizaron experimentos como el descrito a continuación. - MUESTRA 1: se mezcla el holoenzima con [3H]DNA del fago T7 y se incuban a 37ºC durante 30 minutos. A continuación, se toma una alícuota (t= 0) y a la mezcla restante se le añade un exceso de DNA de T7 no-marcado. Se incuba a 25ºC y se van tomando alícuotas a diferentes tiempos. Las alícuotas se filtran a través de una membrana de nitrocelulosa (une proteína) y, a continuación, se mide la radiactividad retenida en la membrana. - MUESTRA 2: se realiza el mismo protocolo que para la muestra 1 pero con el núcleo (core) del enzima (en lugar de con el holoenzima). La gráfica muestra el porcentaje de radiactividad retenida en la membrana de las alícuotas tomadas a cada tiempo. Negro= Muestra 1; Blanco: Muestra 2. a) De qué es una medida la radiactividad retenida y qué conclusiones sacas sobre el papel del factor σ? Holoenzima + [3H]-DNA T7, 37ºC, 30 minutos = Unión Holoenzima + DNA; t=0 todo unido, por lo que al pasarlo por el filtro se une el holoenzima al filtro y por lo tanto el DNA marcado. Al añadir exceso DNA T7 NO marcado, hay una competencia entre los DNAs, es decir, la RNAP se desune de una molécula de DNA para unirse a otra en función de su kD. Cómo la KD es muy baja, la mayor parte no se desune del marcado. El poco DNA no marcado que ha unido holoenzima al final (60 min) queda retenido en el filtro, pero no da señal. En el caso del núcleo de enzima (muestra 2), la unión inicial ya no es tan buena, y la competencia se da clarísimamente, ya que la kD es muy alta (inespecífica). Esto indica que el factor  es el que da la especificidad de unión al promotor b) Teniendo en cuenta que el DNA presenta sitios de unión a RNAP con afinidades diferentes (mayor afinidad, menor afinidad) y considerando el ensayo desde el punto de vista cinético, ¿qué velocidad crees que se puede determinar con el método experimental descrito? La velocidad es la transferencia entre moléculas de DNA, con lo que se pueden calcular las KD.

AxBy  xA + yB; kD= [A]x[B]y/[AxBy] NOTA: Con la incubación inicial de 30 minutos a 37ºC se alcanza el estado estacionario. 16.- Para estudiar un operón de E. coli que contiene 3 regiones que responden diferencialmente frente a la inducción, realizamos una conjugación y obtenemos dobles diploides parciales. En la tabla se muestran diferentes genotipos y el fenotipo observado en ausencia y presencia de inductor ("+" indica que hay síntesis del enzima producto del gen estructural, "-"indica que la síntesis es poca o nula).

Fenotipo Haploide:

Diploide:

Genotipo a-b+c+ a+b+ca+b-ca+b-c+/a-b+ca+b+c+/a-b-ca+b+c-/a-b-c+ a-b+c+/a+b-c-

- inductor + + + +

+ inductor + + + + + +

¿Cuál de estos genes (a, b, c) es el regulador, el operador y el gen estructural? Explica el porqué de tu asignación. Control - inducible  Hay un represor que se une al operador cuando no hay inductor Un operador actúa en cis: ha de estar al lado del gen al que le provoca el efecto (estructural). Esto pasa en general con secuencias de DNA Regulador actúa en trans: NO ha de estar al lado de el gen al que le provoca el efecto (estructural). Es decir, imaginar el operon lac, si me llevo el gen lacI a un plásmido, no pasa absolutamente nada, ya que se producirá el mRNA igualmente (y en la misma cantidad), y por lo tanto la cantidad de proteína final también será igual. a-b+c+, síntesis constitutiva, no regula. a es represor u operador b o c son estructural (imaginar β-galactosidasa) a+b+c-, confirma a+b-c-, confirma a+b-c+/a-b+c-, no permite discernir (pero al final sí que confirma) a+b+c+/a-b-c-, no permite discernir, simplemente la primera copia hace que se comporte como es de esperar de un sistema de control negativo inducible a+b+c-/a-b-c+, regula. c es el gen codificante para el represor b ha de ser el estructural

a ha de ser operador a-b+c+/a+b-c, constitutivo, Efectivamente, a es operador, ya que solo funciona cuando está en cis con el b. 17.- Un operón compuesto por un gen regulador, un promotor y un gen estructural está sujeto a control positivo reprimible. Control + reprimible  Hay un activador que se une al promotor (región de unión del promotor, no de la RNA polimerasa)cuando no hay co-represor

WT MT-1 MT-2 MT-3 MT-4 MT-5

Genotipo a+b+c+ a+b-c+ / a+b+ca-b+c- / a+b-c+ a-b-c+ / a+b+ca+b-c+ / a+b-c-

Fenotipo Sin co-represor Con co-represor + + + + +

a) Cuál es el fenotipo de la cepa salvaje (wt)? Sin co-represor Con co-represor + b) Quien gen es el regulador? 1. buscar el estructural = fenotipo -, - = MT-2 (a-b+c- / a+b-c+) MT-4 (a+b-c+ / a+b-c-) El gen b es el estructural. En la primera copia de MT-2 no puede dar actividad pq tiene mutado el sitio de unión del activador (sea a...