Proteínas PDF

Preview

Summary

AISLAMIENTO, PURIFICACIÓN Y DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DEPROTEINASMartínez, Lizeth 218076305 (martinezlizeth87@gmail), Navarro, Adriana 218076381(adrianasofiang@gmail), Morcillo, Jhon 218076352 (alexis04208@gmail), Chamorro, Jimmy 218076129 (jimmychamorro1305@gmail), Guaquez, Jose 218076241 (joselgu...

Description

AISLAMIENTO, PURIFICACIÓN Y DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE PROTEINAS Martínez, Lizeth 218076305 ([email protected]), Navarro, Adriana 218076381([email protected]), Morcillo, Jhon 218076352 ([email protected]), Chamorro, Jimmy 218076129 ([email protected]), Guaquez, Jose 218076241 ([email protected]), Cortez, Esteban 218076156 ([email protected]) Docente: Eliana Oviedo García Laboratorio Bioquímica II, Medicina, Semestre II, Universidad de Nariño - Pasto, Colombia Mayo 24, 2019 RESUMEN En la práctica de aislamiento, purificación y cuantificación de proteínas presentes en la ovoalbúmina fue necesario llevar una serie de pasos que permitieron en primera instancia obtener la proteína para luego mediante método de Biuret identificar su presencia y así cuantificarla a través del espectrofotómetro, para posteriormente realizar ciertos cálculos que permiten calcular exactamente la cantidad de proteína en valores numéricos y representarlo gráficamente en una curva. A partir de esto se puede comprender la importancia de la cuantificación de proteínas en el ser humano y que su déficit reduce las reservas de sangre en hígado y músculos lo que predispone a padecer graves patologías. PALABRAS CLAVE: aislamiento, purificación, cuantificación, proteínas, ovoalbúmina, Biuret, espectrofotómetro, curva, gráfica, patologías. INTRODUCCIÓN Las proteínas están presentes en todas las células y en los distintos líquidos corporales: suero o plasma (66-83g/L), orina (100-200 mg/L), líquido cefalorraquídeo (15-45 mg/dL). Si nos centramos en las proteínas plasmáticas, podemos diferenciar: · Proteínas plasma-específicas: componentes habituales del plasma. · Proteínas no plasma-específicas: aquellas que aparecen en el plasma por rotura de otras células. Las proteínas plasma-específicas (albúmina + globulinas) se sintetizan fundamentalmente en el hígado, pero también en: células plasmáticas, ganglios linfáticos, bazo y médula ósea. En caso de enfermedad, tanto la concentración total como la de las distintas fracciones pueden verse alteradas. Así, la determinación de las proteínas totales sirve para el diagnóstico de: · Afecciones hepáticas · Afecciones de la médula ósea · Otras afecciones del metabolismo o nutricionales11 Y 12. En el aspecto clínico el consumo de la ovoalbúmina es de gran importancia ya que ayuda a sintetizar la albúmina, que es una de las más importantes proteínas plasmáticas producidas en el hígado. Entre sus múltiples funciones se incluye nutrición, mantenimiento de la presión oncótica

y transporte de sustancias como Ca++, bilirrubina, ácidos grasos, drogas y esteroides. Alteraciones en los valores de albúmina indican enfermedades del hígado, desnutrición, lesiones de la piel como dermatitis, quemaduras severas o deshidratación. El diagnóstico clínico debe realizarse teniendo en cuenta todos los datos clínicos y de laboratorio, de ahí lo importante de la cuantificación de proteínas en el ser humano13 Y 14. La cuantificación exacta de proteínas es esencial para detectar patologías en el organismo del ser humano e inclusive para diversos temas de investigación que desarrollen soluciones a al déficit de proteínas asociadas por patologías que mejoren la calidad de salud de las personas. El método para este caso es el uso del espectrofotómetro para cuantificación, previamente ya usado el reactivo Biuret para determinar presencia de la ovoalbúmina.

PROCEDIMIENTO El desarrollo del presente laboratorio se llevó a cabo en dos etapas: la primera consistió en la extracción y purificación de la proteína Ovoalbúmina y la subsiguiente, en la cuantificación de ésta, aplicando el método Biuret. A continuación se citan algunos de los procedimientos que se llevaron a cabo para la obtención de resultados:  Primera etapa: Aislamiento purificación de la proteína:

y

Se procedió a filtrar una clara de huevo usando una malla de media de Nylon y vertiéndola en un Erlen Mayer previamente tarado. Se pesó la cantidad de clara de huevo obtenida, agregándole suavemente el mismo número de ml de solución saturada de sulfato de amonio concentrado como de gramos de clara de huevo obtenidos en el filtrado. Posteriormente, se llevó a centrifugación (3000 rpm por 5 minutos).

El sobrenadante se filtró a través de una mota de algodón situada en el vértice de un embudo: Al filtrado resultante se le añadió solución saturada de sulfato de amonio gota a gota hasta que el líquido se volvió turbio. Se le añadió también ácido acético al 25%, gota a gota, controlando con papel indicador que el pH de la solución se situara próxima a 4.5. Se llevó la solución nuevamente a centrifugación (3000 rpm por 5 minutos). Se disolvió el precipitado en 20 ml de agua

destilada. Se transfirió a otro recipiente, filtrándolo a través de un embudo con una mota de algodón. Al filtrado se le añadió lentamente y con agitación 20 ml de acetona. Se separó el precipitado con ayuda de centrifugación, el cual se sitió en un vidrio de reloj adicionando 20 ml de éter y se dejó secar al aire, obteniendo una pequeña cantidad de polvo, usada en la etapa II – Cuantificación de la proteína.  Cuantificación de la proteína – método Biuret: El desarrollo de esta etapa se llevó acabo preparando solución acuosa de Ovoalbúmina de concentración 5 mg/ml, la cual fue dispuesta en dos tubos de ensayo rotulados como 8 y 9 respectivamente. En el tubo 8 se agregó 0.5 ml de proteína, además de 1.5 ml de agua destilada y 3 ml de Reactivo de Biuret; en el tubo 9 se agregó 1 ml de proteína, 1 ml de agua destilada y 3 ml de Reactivo de Biuret.

Posteriormente, los tubos de ensayo fueron llevados al Espectrofotómetro. Lo anterior con el ánimo de conocer la absorbancia de la proteína en la solución acuosa y a partir de este dato poder calcular su concentración y construir la curva de calibración. RESULTADOS Y ANÁLISIS

La malla de Nylon garantiza minimizar la cantidad de impurezas y partículas presentes en la clara del huevo, considerando además que da paso a la proteína Albúmina, por ser ésta de menor diámetro que los agujeros de la malla. Del Sulfato de Amonio se puede destacar que la utilización de este se debe a que es una sal inorgánica con una alta solubilidad que se disocia en amonio (NH4+) y dos sulfatos (SO42−) en soluciones acuosas. Lo que explica la precipitación de la ovoglobulina (variedad de albumina que representa entre el 6 y 10% de las albuminas de la clara del huevo) es que a medida que aumenta la concentración de sal, la solubilidad de la proteína comienza a disminuir. Cuando los iones de amonio (NH4+) y sulfato (SO42−) están dentro de la solución acuosa se sienten atraídos por las cargas opuestas en el compuesto que se está purificando. Esta atracción de cargas opuestas evita que las moléculas de agua interactúen con el compuesto que se está purificando (proteína), lo que lleva a su precipitación. 1 El ácido acético por su parte, permite incrementar el pH de la solución, el cual para efectos de este laboratorio debía situarse cercano a 4.5, pH correspondiente al punto isoeléctrico de la ovoalbúmina y al cual se produce su precipitación porque su solubilidad desciende considerablemente. Lo anterior se debe a que la interacción de los grupos ionizables de la proteína, por ejemplo sus extremos carboxilos, interactúan con los hidrogeniones aportados por el ácido acético, haciendo que el número de cargas negativas de la molécula sea igual al de cargas positivas, es decir su carga sea neutra, lo que

conlleva a perder afinidad por el agua y por ende a su precipitación. 2

grupo de laboratorio, el cual si había obtenido proteína en polvo.

Con respecto a la acetona, utilizada en el laboratorio, se puede justificar su uso, por constituir un solvente orgánico miscible con el agua, el cual disminuye la solvatación de esta, es decir, disminuye su interacción con los iones del soluto (la proteína) y la estructura ordenada del agua alrededor de los aminoácidos hidrofóbicos es desplazada por el solvente, ocasionando la precipitación de la proteína. 3

Lo destacable en la segunda etapa es la composición del reactivo de Biuret y su acción en la solución de proteína acuosa, que para esta práctica fue de 5 mg / ml de ovoalbúmina. El Biuret está hecho de hidróxido de sodio (NaOH) y sulfato cúprico (CuSO4), junto con tartrato de sodio y potasio (KNaC4O6·4H2O). Cambia a violeta en presencia de proteínas. El hidróxido de potasio no participa en la reacción, pero proporciona el medio alcalino necesario para que tenga lugar.

Por último, en esta primera etapa se usó Éter Etílico, un reactivo que al igual que los descritos anteriormente producen la precipitación de la albumina, producto además de la coagulación que sufre por presencia de este, misma reacción que provoca el calor, los ácidos minerales y el alcohol. 4 Es importante aclarar que en la aplicación de la primera etapa – Aislamiento y Purificación de la proteína – no fue posible obtener una cantidad aceptable de proteína en forma de polvo, lo cual pudo deberse a la agregación insuficiente de sulfato de amonio concentrado posterior al primer centrifugado. Infortunadamente dicho reactivo se había agotado y solo quedaban algunas gotas que no fueron suficientes para que la solución se tornara turbia, tal como lo requería la guía de laboratorio. Con lo anterior se puede inferir que la albumina no entró en contacto con el reactivo suficiente para que esta pudiera precipitarse, justificando además el poco sedimento obtenido posterior al segundo centrifugado. Para poder continuar con la segunda fase del laboratorio – determinación cuantitativa de la proteína – se procedió a trabajar con una cantidad de proteína suministrada por otro

En la preparación de los tubos de ensayo que se llevaron al Espectrofotómetro, se evidenció la coloración violeta. Esta reacción la producen los péptidos y las proteínas, pero no los aminoácidos ya que se debe a la presencia del enlace peptídico CONH que se destruye al liberarse los aminoácidos en la presencia de Biuret. La

siguiente reacción ilustra el efecto químico del Biuret: La anterior reacción representa la formación de una coloración violácea por formación de un complejo de coordinación entre el Cu+ + y los pares electrónicos libres de los nitrógenos de los grupos amino de la unión peptídica. Son necesarias por lo menos dos uniones peptídicas para que tenga lugar la reacción. 5

Con el ánimo de realizar la gráfica de la curva de calibración, se procedió a usar los datos de concentración señalados en la guía de laboratorio y los valores de absorbancia obtenidos para cada uno de los 7 tubos que se procesaron en el espectrofotómetro. Cabe destacar la funcionalidad del dispositivo mencionado anteriormente, el cual es usado para la cuantificación de sustancias, en este caso de proteínas. El funcionamiento de este instrumento consiste básicamente en iluminar la muestra con luz blanca y calcular la cantidad de luz que refleja dicha muestra en una serie de intervalos de longitudes de onda.6 Tubo 1 2 3 4 5 6 7

Concentraci Absorbanc ón ia 0.1 mg 0.139 0.3 mg 0.171 0.5 mg 0.181 0.7 mg 0.209 0.9 mg 0.233 1.2 mg 0.255 1.5 mg 0.294

ocasión como muestra patrón es la caseína, la cual guarda una relación proporcional en cuanto a concentración y absorbancia con la proteína a evaluar, la ovoalbúmina. Por lo anterior, es posible, mediante la fórmula de la función Y=mx+b, despejar la concentración desconocida en los tubos 8 y 9, procesados en laboratorio para ovoalbúmina en solución con Biuret y agua destilada. A continuación los cálculos para encontrar la concentración desconocida de ovoalbúmina: Tomamos la fórmula de la curva de calibración: Y = mX + b Y = 0.1068X + 0.1324 Conocemos Y que es absorbancia en los tubos 8 y 9, se despeja X que sería la concentración de las muestras: Y (absorbancia) tubo 8 = 0.094 Y (absorbancia) tubo 9 = 0.088  Concentración tubo 8: X=Y–b m X = 0.094 - 0.1324 0.1068 X = 0.359

La curva de calibración permite, a través de una relación proporcional entre la concentración de una sustancia (para este caso ovoalbúmina), y una señal analítica, que bajo este método consiste en la absorbancia. La proteína usada en esta

El valor anterior lo multiplicamos por 5 considerando que el valor de absorbancia se obtuvo al diluir la solución inicialmente preparada con Biuret, en agua destilada en proporción 1 / 4. Concentración tubo 8 = 0.359 * 5 Concentración tubo 8 = 1.795 mg

 Concentración tubo 9: X = 0.088 - 0.1324 0.1068 X = 0.415 Concentración tubo 9 = 0.415 * 5 Concentración tubo 9 = 2.08 mg Con respecto a la curva de calibración, se puede descartar que el valor de R2 (coeficiente de determinación) es muy cercano a 1, lo que indica que la curva y por ende su ecuación es muy confiable para el cálculo de las concentración desconocidas. Con respecto a las concentraciones desconocidas (Ovoalbúmina) se puede observar que tanto en los tubos 8 como 9 se obtuvieron valores de concentración por debajo de lo esperado (5mg /ml) lo cual indica que la proteína obtenida en el laboratorio no es de la pureza que se esperaba al aplicar el protocolo de extracción y purificación. Los pasos de preparación de la muestra patrón fueron realizados con estricto cuidado y garantizando seguir lo indicado por la guía, por lo cual se puede concluir que puso haberse presentado algún inconveniente en la purificación de la proteína, lo cual determinó la presencia de impurezas en la proteína. Lo anterior explica además la razón por la cual a pesar de obtener el peso requerido para la espectrofotometría 5mg/ml, pero no la absorbancia ajustada a dicha concentración. DISCUSIÓN En una evaluación comparativa bibliográfica con los experimentos hechos en el programa de medicina de la UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA en los

procesos de aislamiento, purificación y determinación cuantitativa de proteínas se observaron puntos de entendimiento desde el proceso de separación y cuantificación hasta su utilidad. En el primer punto del proceso se pudo observar la utilidad del sulfato de amonio el cual empieza con una acción foculante debido a una aglutinación de sustancias coloidales en el agua esto en post de una facilidad de purificación debido a su acción de compuesto sulfatado, donde se encuentra que facilita la hidrolisis de los enlaces peptídicos en una función de coagulaciónfloculación donde facilita la retirada de sustancias y partículas, nota Los factores que pueden promover la coagulación-floculación son el gradiente de la velocidad, el tiempo y el pH. El tiempo y el gradiente de velocidad son importantes al aumentar la probabilidad de que las partículas se unan y da más tiempo para que las partículas desciendan, por efecto de la gravedad, y así se acumulen en el fondo. Por otra parte el pH es un factor prominente en la acción desestabilizadora de las sustancias coagulantes y floculantes. Avanzando con el procedimiento observamos el cambio de la ovoglobulina (de la familia de las albuminas) esta proteína presente en el 10% de la clara del huevo se coagula y se precipita con la solución salina saturada de sulfato de amonio. Nota: (7) (este precipitado redisuelto en agua sirve las reacciones de caracterización de las proteínas, dando positiva la prueba de Molisch, que detecta la presencia de glúcidos, debido a que contiene una proporción importante de glucoproteínas). Procediendo a la centrifugación la teoría nos refiere a que en esta técnica de sedimentación es una centrifugación

diferencial dado a que se obtiene un sedimento (soluble) y un sobrenadante Después de haber formado el líquido totalmente turbio aun cuando no se observe una clara precipitación, se agrega ácido acético para que el PH del punto isoeléctrico para que la solubilidad de la sustancia se vuelva casi nula esto con la posterior adición de acetona para que después de las centrifugaciones el precipitado con el agua destilada pueda tener una mejor evaporación y obtención de proteínas. En la relevancia significativa de estos procesos comparados con bibliografía miramos la purificación de proteínas como una serie de procesos que permiten aislar un sólo tipo de proteína de una mezcla compleja. También que La purificación de proteínas es vital para la caracterización de la función, estructura e interacciones de la proteína de interés, por ejemplo una enzima un receptor celular o un anticuerpo9. El material inicial es generalmente un tejido biológico o un cultivo microbiano. Hay varios pasos en el proceso de purificación; puede liberar a la proteína de la matriz que lo confina, separar las partes proteica y no proteica de la mezcla, y finalmente separar la proteína deseada de todas las demás7. Este último paso puede ser el aspecto más laborioso de la purificación de proteínas. En el campo de cuantificación hubo marcos comparativos en cuanto a discrepancia de la cantidad de proteína y entre otro punto está la enmarcación dada como aprendizaje a la absorbancia ultravioleta que nos dice que Los aminoácidos aromáticos tirosina y triptófano confieren a las proteínas su característico espectro de absorción ultravioleta (UV) a 280 nm. La fenilalanina

y los puentes disulfuro también pueden contribuir a la absorción en esa longitud de onda, aunque ligeramente. Este método es simple y requiere de un volumen de muestra extremadamente pequeño ya que los nuevos espectrofotómetros emplean un sistema de retención de muestra durante la medición. Sin embargo10, la muestra proteica debe ser pura y no contener componentes no proteicos con el mismo espectro de absorción, tales como ácidos nucleicos contaminantes. Se debe conocer la secuencia exacta de los aminoácidos de la proteína analizada y calcular el coeficiente de absorción específico de esa proteína previa a la determinación de la concentración en solución]. Este método es el más rápido, pero propenso a errores. Entre otros puntos de relevancia bibliográfica se referencia las utilizaciones medicas tales como: En los casos especiales de intoxicación por metales pesados (tales como el hierro) se puede administrar unas dosis de ovoalbúmina. La ovoalbúmina está relacionada con los metales pesados y su misión es la de atrapar los iones de los metales pesados debido a la presencia de las uniones sulfhídricas de la proteína. Su coagulación tras el proceso de absorción previene la absorción de metales en el tracto gastrointestinal previniendo el 8 envenenamiento . En algunos casos, es utilizada para aliviar quemaduras o como regenerador de la piel. Otros casos vistos son los de diversia: 



Existen alergias alimentarias a los huevos debido a la alergia que se pueda tener a esta proteína del huevo. La proteína coagula a 80 °C y esto se debe tener en cuenta al cocinar huevos, la primera proteína del huevo en

 

coagular es la ovotransferina (70 °C) * Esta proteína forma parte de los piensos dados en la industria avícola para alimentar a las crías. También se puede proporcionar en combinación con hidratos de carbono para regenerar a aves débiles. Se usa como sustituto del huevo en ciertas aplicaciones alimenticias, como la huevina. Se emplea puro (generalmente en grageas) en la nutrición deportiva como un suplemento proteínico a la dieta: sobre todo en los deportes de fuerza como el culturismo.

concentraciones de la muestra de ovoalbúmina, esto comparando con la gráfica que se construye a partir de las absorbancias leídas, entonces se reforzó la construcción de curvas de calibración relacionando la absorbancia y la concentración, evidenciando una relación directamente proporcional, a partir de esto se pudo identificar la concentración de la proteína.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS 1. Wingfield, Paul. «Protein Precipitation Using Ammonium Sulfate». www.ncbi.nlm.nih.gov.

CONCLUSIÓN Las proteínas son necesarias para diversas funciones que el cuerpo realiza normalmente, como mantenimiento, crecimiento, reproducción, lactación y producción de pelo.

2.https://es.scribd.com/document/376249126 /Punto-Isoelectrico-de-la-albumina

El déficit de proteína en la dieta reduce las reseras en sangre, hígado y músculo...