Proteinbestimmung Fluorometrie 5A-3 PDF

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Protokoll Proteinbestimmung und Fluorometrie BAT 2...

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Beuth-Hochschule für Technik Studiengang Biotechnologie

Sommersemester 2020

Bioanalytik II Modul (BAT II) Protokoll zum Versuch Proteinbestimmung und Fluorometrie

Das Protokoll basiert auf unseren eigenen Daten und wurde von uns selbstständig verfasst.

Berlin, den 19.08.2020

Inhaltsverzeichnis

Gruppe 5-A3

1. Einleitung................................................................................................................3 1.1

Aufgabenstellung...........................................................................................4

2. Material und Methoden...........................................................................................5 3. Ergebnisse..............................................................................................................5 3.1 Proteinbestimmung über Extinktionsmessung bei 280 nm..........................5 3.2 Proteinbestimmung mittels BCA-Methode.....................................................8 3.3 Konzentrationsabhängigkeit und Fluoreszenzlöschung............................10 4. Diskussion............................................................................................................12 4.1

Proteinbestimmung über Extinktionsmessung bei 280 nm und mit Hilfe

der BCA Methode...................................................................................................12 4.2 Konzentrationsabhängigkeit und Fluoreszenzlöschung............................14 5. Literaturverzeichnis...............................................................................................15 6. Anhang..................................................................................................................15 6.1 BSA-Standardreihe für die Proteinbestimmung mittels BCA-Methode.............15 6.2 Pipettierschema für Herstellung der Chininsulfatlösung...................................16

2 Bioanaltik II Modul (BAT II) Sommersemester 2020

1. Einleitung Eine der am wichtigsten analytischen Methoden der Biotechnologie, aber auch anderer

wissenschaftlicher

Bereiche

ist

die

Proteinbestimmung.

Sie

wird

überwiegend in der Biotechnologie, Medizin und Lebensmittelanalytik eingesetzt und dient zur Quantifizierung der Proteine. (Lottspeich, 2006) Das Prinzip der Proteinbestimmung ist der Vergleich einer unbekannten Probe mit bekannten analytischen Standardwerten, um unter anderem die Konzentration des Proteins in einer unbekannten Probe zu bestimmen. Zur Proteinbestimmung können verschiedene Methoden durchgeführt werden, welche für ein verlässliches Ergebnis unter anderem von der Proteinkonzentration, -variation, den Begleitsubstanzen und dem Aufwand der jeweiligen Methode abhängig ist. In diesem Praktikum werden zwei verschiedene Methoden der Proteinbestimmung durchgeführt. Zum einen die Proteinbestimmung über eine Extinktionsmessung bei einer Wellenlänge von 280 nm und zum anderen die BCA-Methode. (BAT II Skript, 2020) Bei der Extinktionsmessung wird die unbekannte Probe direkt photometrisch bei einer definierten Wellenlänge vermessen und kann anschließend mit Hilfe eines zuvor

bestimmten

Standards,

beispielsweise

BSA

(Rinderserumalbumin)

ausgewertet werden. Eine weitere sehr effektive und auf der Spektroskopie beruhende Methode ist die BCA-Methode, bei der ein Kupferreagenz zur unbekannten Probe hinzugegeben wird und mit den enthaltenen aromatischen Aminosäuren in der Proteinlösung reagieren und das Kupfer reduzieren, sodass ein Purpurroter Farbkomplex entsteht. Die Intensität der Färbung wird anschließend photometrisch vermessen und zeigt eine Abhängigkeit

zur

Proteinkonzentration,

da

die

enthaltenen

aromatischen

Aminosäuren Tyrosin, Cystein, Tryptophan und die vorhandenen Peptidbindungen je nach

Protein

und

-konzentration

variieren

und

somit

unterschiedliche

Farbintensitäten ausgewertet werden können. (Richter, 2003) Ein weiteres Teilgebiet der Biotechnologie beschäftigt sich mit der Fluorometrie. Die Fluorometrie ist eine spezielle Form der Spektroskopie, wobei die auszuwertenden Moleküle absorbiertes Licht bei einer längeren Wellenlänge emittieren. Mit Hilfe eines Fluoreszenzspektrometers Bioanaltik II Modul (BAT II) Sommersemester 2020

kann

so

vorhandene

Fluorophore

detektiert

und 3

gemessen werden, zudem kann anschließend ein Zusammenhang mit der Konzentration festgestellt werden. Das fluorometrische Messverfahren wird unter anderem dazu verwendet, um organische Moleküle innerhalb eines Proteins zu untersuchen. (Meine, 1998) In diesem Praktikum wurde der Zusammenhang der Fluoreszenz zur Konzentration untersucht, zusätzlich wurde untersucht, welche Auswirkung Quencher auf die Fluoreszenzintensität haben. Quencher sind Substanzen und Stoffe, welche die durch die Fluoreszenz emittiertes Licht wieder absorbieren und somit die Fluoreszenz abschwächen, oder sogar löschen. (Schmidt, 2000) 1.1

Aufgabenstellung

Das Ziel der im Praktikum durchgeführten Versuche war es zum einen drei verschiedene

unbekannte

Proben A-C

zu

untersuchen

und

die

jeweilige

Proteinkonzentration zu bestimmen. Im ersten Versuch sollten die bei 280 nm vermessenen Proben mit dem BSA-Standard verglichen werden und somit die Konzentration berechnet werden. Der zweite Versuch hingegen beinhaltete die BCALösung, welche zu den Proben hinzu pipettiert wurde und eine Reduktion des sich im BCA befindenden Kupfers verursachte. Zuvor wurden die Proben nach einem Pipettierschema verdünnt. Zudem wurde für die jeweilige Konzentration und Probe eine Doppelbestimmung durchgeführt. Das Ziel des Versuches war es ebenfalls die Konzentration

der

unbekannten

Proben

zu

bestimmen,

wofür

eine

BSA-

Standardreihe hergestellt wurde, die mit Excel ausgewertet werden sollte und über eine Geradengleichung konnten so die Konzentrationen ermittelt werden. Die erhaltenen Ist-Werte der Konzentrationen der unbekannten Proben sollten anschließend mit den zur Verfügung stehenden Soll-Werten verglichen werden. Das

Ziel

des

letzten

Versuches

zur

Fluorometrie

war

es

die

Konzentrationsabhängigkeit und Fluoreszenzlöschung zu analysieren. Dafür wurde eine Chininsulfat-Lösung in verschiedenen Konzentrationsstufen hergestellt, welche anschließend mit dem Fluoreszenzspektrometer vermessen wurden. Die Proben wurden jeweils ohne und mit Quencher in eine Mikrotiterplatte pipettiert, sodass ebenfalls die Zugabe eines Quenchers untersucht werden konnte, ob eine Fluoreszenzlöschung vorliegt oder nicht. Des Weiteren sollte analysiert werden 4 Bioanaltik II Modul (BAT II) Sommersemester 2020

inwieweit die Fluoreszenz von der Konzentration eines natürlichen Fluorophors abhängt.

2. Material und Methoden Die in dem Praktikum verwendeten Materialien und Methoden wurden wie im Skript „BAT II – Proteinbestimmung und Fluorometrie SoSe 2020“ (Stand 17.04.2020) angewandt. Zu den Versuchen gab es keine Änderungen der Materialien und Methoden.

3. Ergebnisse 3.1 Proteinbestimmung über Extinktionsmessung bei 280 nm Die Proteinbestimmung über die photometrische Extinktionsmessung bei einer Wellenlänge von 280 nm wurde mit Hilfe eines BSA-Standards durchgeführt. Dafür mussten zunächst 10 mL einer BSA-Standardlösung von 1 mg/mL aus einer BSAStammlösung von 10 mg/mL über eine 1:10 Verdünnung mit 0,9% NaCl-Lösung hergestellt werden. Die 0,9% NaCl-Lösung wurde wie folgt hergestellt: ß %=

m∈g 100 mL

ß %=

0,9 g 100 mL

Für die NaCl-Lösung wurden also 0,9 g eingewogen und auf 100 mL aufgefüllt. Mit dieser Lösung wurden alle weiteren Versuche und Verdünnungen durchgeführt. Um nun die BSA-Standardlösung herzustellen wurden 1 mL der Stammlösung und 9 mL der NaCl-Lösung zusammen pipettiert. Im Anschluss wurde der BSA-Standard photometrisch bei 280 nm vermessen. Die Werte können der Tabelle 1 entnommen werden. Um zu überprüfen, ob die Extinktion der BSA-Standardlösung dem Soll-Wert entspricht, wurde zuvor die Extinktion E BSA mit Hilfe des Bouguer-Lambert-Beerschen Gesetz berechnet. E=log10 wurden

( II )=ε ×c ×d

Gegeben

0

das

Molekulargewicht

von

BSA

(MW BSA

=

66,5

kDa),

der

Extinktionskoeffizient von BSA (εBSA = 43.824 M-1cm-1) und die Konzentration von 5 Bioanaltik II Modul (BAT II) Sommersemester 2020

BSA (1 mg/mL). Mit diesen Daten konnte wie folgt die Extinktion von BSA mathematisch berechnet werden. Für die Konzentration c wurde folgendes eingesetzt: c=

ß M

c=

1 mg / mL −5 =1,5 ×10 mol / L 66500 mg/mol

Anschließend

werden alle Daten in die Formel von Lambert-Beer eingesetzt und berechnet. E=43.824 L mol−1 cm−1 ×

1 g/mol ×1 cm=0,66 66500 L g

Die

erwartete Extinktion des BSA-Standards betrug 0,66. Dies entsprach ungefähr den gemessenen Extinktionen des BSA-Standards (s. Tabelle 1) . Des Weiteren wurden die unbekannten Proben A-C und die verwendeten Puffer zunächst einmal unverdünnt bei 280 nm vermessen (s. Tabelle 1). Dabei sollten die jeweiligen Extinktionen in einem linearen Bereich des Photometers bei 0,1-1,4 liegen. Tabelle 1: Extinktionsmessung der aufgezählten Proben bei 280 nm mit Doppelbestimmung und Mittelwert, Probe A unverdünnt und verdünnt

Probe Extinktion 1 BSA-Standard (1 0,663 mg/mL) Probe A 2,271 Probe A (1:5) 0,647 Probe B 2,852 Probe C 0,556 PBS -0,005 Tris-HCl 0,007 Triton X 2,735

Extinktion 2 0,677

Mittelwert 0,67

_ 0,647 _ 0,550 -0,006 0,007 2,763

_ 0,647 _ 0,553 -0,0055 0,007 2,749

Aus der Tabelle 1 zu entnehmen sind die Extinktionen bei 280 nm des BSAStandards, der Proben A-C und der jeweiligen verwendeten Puffer. Nach der ersten Extinktionsmessung konnte festgestellt werden, dass die Extinktion der Probe A und B über den linearen Bereich des Photometers lagen. Probe C hingegen lag mit einer durchschnittlichen Extinktion von 0,553 im linearen Bereich, weshalb direkt eine Doppelbestimmung durchgeführt wurde. Anschließend wurden die Proben photometrisch bei 280 nm vermessen, um herauszufinden, ob die Puffer einen Einfluss auf die Extinktionswerte der Proben hatten. Dabei kann der Tabelle 1 entnommen werden, dass Tris-HCl, sowie PBS-Puffer keinen ausschlaggebenden Einfluss auf die Extinktionswerte haben, da diese Puffer keine, beziehungsweise eine 6 Bioanaltik II Modul (BAT II) Sommersemester 2020

minimale Eigenabsorption aufweisen. Triton X hingegen, weist eine sehr große Eigenabsorption auf, die der ungefähren Extinktion der Probe B entsprach. Da Triton X

eine

sehr

hohe

Eigenabsorption

aufweist,

wurde

die

Probe

B

nicht

weiterverwendet, da dies zu verfälschten Ergebnissen führen könnte. Die Probe A hingegen wurde 1:5 mit 0,9% NaCl verdünnt und erneut vermessen (s. Tabelle 1). Die neuen Extinktionswerte befanden sich im linearen Bereich, weshalb sowohl für Probe A als auch Probe C die Proteinkonzentrationen bestimmt werden konnte (s. Tabelle 2). Tabelle 2: Mit den Gleichungen 2 und 3 ermittelte Konzentrationen der unbekannten Proben A-C

Probe Mittelwert E ß (mg/mL) Soll-Wert (mg/mL) A (1:5) 0,647 0,966 0,647 4,83 7 A unverdünn t B 0,3 C 0,553 0,825 0,8 Für die Proteinkonzentrationsberechnungen wurden folgende Verhältnisgleichung und die notwendigen Daten zu dem BSA-Standard verwendet. ß Standard E Standard

=

ß Probe E Probe



ß A=

ß Standard × E A E Standard

Diese

Verhältnisgleichung wurde anschließend so umgestellt, dass die Konzentration ß der unbekannten Proben ausgerechnet werden konnten. Für ßStandard wurde die Konzentration der BSA-Standardlösung (1 mg/mL) eingesetzt. Für die jeweiligen Extinktionen wurden die photometrisch ermittelten Werte des BSAStandards (0,67), sowie der Probe A (0,647) eingesetzt. mg × 0,647 mL ß Averd .= =0,966 mg / mL 0,67 1

Da dieses

Ergebnis auf die verdünnte Lösung der Probe A bezogen ist, wird ß A mit dem Verdünnungsfaktor

(VF)

von

5

multipliziert,

um

die

Konzentration

der

Ausgangslösung zu ermitteln, welche 4,83 mg/mL betrug. Für die Probe C wurde dieser Rechenweg analog durchgeführt. Für ß Standard und EStandard wurden erneut die Werte des BSA-Standards eingesetzt. Für E C wurde der Mittelwert der Extinktion der Probe C eingesetzt (s. Tabelle 1) 7 Bioanaltik II Modul (BAT II) Sommersemester 2020

Da Probe C bereits unverdünnt vermessen wurde, musste nicht mehr mit einem Verdünnungsfaktor gerechnet werden. So erhielt man eine Konzentration von 0,83 mg/mL. Die zu vergleichenden Soll-Werte können ebenfalls der Tabelle 2 entnommen werden. 3.2 Proteinbestimmung mittels BCA-Methode Mit

Hilfe

der

BCA-Methode

und

einem

BSA-Standard

können

die

Proteinkonzentrationen der unbekannten Proben A-C ebenfalls ermittelt werden. Hierfür wurde eine BSA-Standardreihe angesetzt, die Extinktionen photometrisch bei 562 nm vermessen und in ein Diagramm gegen die Konzentration ß [ug/mL] aufgetragen (s. Abbildung 1). Die ermittelten Extinktionen der Standardreihe sind im Anhang unter 6.1 zu finden. 0.8 0.7

Extnkton

0.6

f(x) = 0 x + 0.01 R² = 1

0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0.00

20.00

40.00

60.00

80.00

100.00 120.00 140.00 160.00 180.00 200.00

ß (µg/mL)

Abbi ldung 1: Da rstel lung der B SA-St anda rreihe der Konzentrat ionen von 0-1 50 mg/ mL aufg etragen in ein D ia gram m gegen die b ei λ =280 nm gemessene Ext inkt ion m it Trendl inie und Gera deng leich ung zur B erechnung der P roteinkonzentration der unbekannten Proben AC

Die Proben wurden unter einem geeignetem Verdünnungsfaktor verdünnt. Dabei sollten die Verdünnungen zwischen 20-80% des höchsten BSA-Standards liegen. Die ausgewählten Verdünnungsfaktoren sind der Tabelle 3 zu entnehmen. Die Proteinkonzentration der Proben A25, sowie B8 wurden nicht ermittelt, da bei beiden Proben die Extinktionswerte zu stark voneinander abweichen und somit ein verfälschter Mittelwert der Extinktion vorlag. Tabelle 3: Ermittelte Konzentrationen der verdünnten unbekannten Proben A-C

Probe VF E1

E2

MW E

ßverd

ßkonz

Soll-Wert

ß 8

Bioanaltik II Modul (BAT II) Sommersemester 2020

A

80

C

(mg/mL) 11,82

198,2

9,9

-

-

25 8

0,057 0,285 0,171

-

-

5

0,259 0,262 0,260 5 0,426 0,472 0,448 5 0,389 0,38 0,384 5 0,48 0,513 0,496 5 0,508 0,508 0,508

70,6

0,353

122,9

0,307

105,1

0,84

136,2

0,681

139,4

0,348

50

B

(µg/mL) 147,8

0,552 0,525 0,538 5 0,808 0,631 0,719 5 1,533 1,167 1,35

2, 5 8 5 2, 5

(mg/mL) 7

0,3

0,8

Die in der Tabelle 3 ermittelten Proben wurden mit Hilfe der Geradengleichung berechnet. Die mit Hilfe der BSA-Standardreihe ermittelten Geradengleichung (s. Abbildung 1) wurde nach der Unbekannten X aufgelöst. Für y wurden die jeweiligen Extinktionen eingesetzt. x = y −0,0061/0,0036

Probe A (1:80) :

Beispiel

X A 80 verd .=0,5385−

0,0061 =147,8 µg/mL 0,0036

Da diese Proben alle

verdünnt sind werden die berechneten Konzentrationen mit dem jeweiligen Verdünnungsfaktor (s. Tabelle 3) multipliziert. X A 80konz .=147,8 ×80=11824

µg =11,82 mg / mL mL

Dieser

Rechenweg wurde analog für alle unbekannten, verdünnten Probe durchgeführt und in einer Tabelle aufgetragen (s. Tabelle 3). Tabelle 4: Extinktionsmessung bei 562 nm der verwendeten Puffer

Probenpuffe Extinktion 1 Extinktion 2 r PBS 0,013 0,004 Tris-HCl 0,008 0,007 Triton X 0,054 0,057 In Tabelle 4 sind die Extinktionswerte der

Mittelwert E 0,0085 0,0075 0,0555 verwendeten Puffer aufgeführt. Diese

wurden vermessen, um eine mögliche Beeinflussung der Extinktionen der 9 Bioanaltik II Modul (BAT II) Sommersemester 2020

unbekannten Proben zu bestätigen oder auszuschließen. In diesem Fall kann bei Triton X aus der Tabelle entnommen werden, dass wider Erwarten eine minimale Eigenabsorption vorliegt. Die Puffer PBS und Tris-HCl weisen ebenfalls eine minimale Eigenabsorption auf, die keinen großen Einfluss auf die Extinktionswerte der Proben hatten. 3.3 Konzentrationsabhängigkeit und Fluoreszenzlöschung Zu Beginn des Versuches wurde ein Pipettierschema angefertigt, mit dessen Hilfe verschiedene Konzentrationen einer Chininsulfat-Lösung hergestellt werden sollte. Dieses Pipettierschema kann dem Anhang 6.2 entnommen werden. Anschließend wurde mittels eines Photometers die Extinktionen der verschiedenen ChininsulfatLösungen C3-C10 ermittelt (s. Tabelle 5). Die Chininsulfat-Lösungen wurden dann einmal mit 2,4-Dinitrosulfat (Quencher) und einmal ohne. Die Proben wurden im Anschluss in eine Mikrotiterplatte pipettiert und mit einem Fluoreszenzspektrometers ausgewertet. Die erhaltenden Werte können der Tabelle 5 entnommen werden. Tabelle 5: Extinktionen der Proben C3-C10 bei einer Wellenlänge von 348 nm, Emission mit und ohne Quencher (2,4-Dinitrophenol) bei einer Wellenlänge von 420 nm in Bezug zur Konzentration ß (µg/mL)

Lösun g C3 C4 C5 C6 C7 C8 C9 C10

ß (µg/mL) 10 5 1 0,5 0,1 0,05 0,01 0

VF

Extinktion Emission ohne Quencher 10 0,184 529773 20 0,087 539678 100 0,015 546621 200 0,003 429279 10 -0,003 93608 20 -0,001 52475 100 -0,007 16286 0 _ 7420

Emission mit Quencher 564947 567410 158083 85121 17883 10303 3509 1742

Um die erhaltenden Extinktionen und Emissionen nun zu analysieren, wurden in der Abbildung

2

die

Absorptionswerte

der

Chininsulfat-Lösung

und

die

Fluoreszenzintensität gegen die Konzentration der Chininsulfat-Lösung aufgetragen. In Abbildung 2 ist deutlich zu erkennen, dass die Fluoreszenz mit Zunahme der Konzentration und somit auch Absorption in den Konstanten Bereich übergeht.

10 Bioanaltik II Modul (BAT II) Sommersemester 2020

0.2

500000

0.15

400000

0.1

300000 0.05

200000

0

0

Emission ohne Quencher Absorpton bei 348 nm

100000 0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

Absorpton

...