Relatório cinética enzimática PDF

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Relatório da aula prática sobre cinética enzimática...

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Universidade Federal de São Carlos Campus Sorocaba Bacharelado em Ciências Biológicas

Cinética enzimática

Docente responsável: Prof. Dr. Vadim Viviani Aula realizada em: 03 de outubro de 2016 Alunos: Gabriela Livreri Stein Mamprin RA 726674 Júlia Costa Zanella RA 726717 Leonardo Alló Pereira RA 726738 Thays Almeida Silva RA 726813 Data de entrega: 11 de outubro de 2016.

1. INTRODUÇÃO

1

Enzimas são proteínas globulares e catalizadores biológicos que, mesmo em pequenas concentrações, são capazes de aumentar a velocidade com que as reações ocorrem. Isso acontece porque elas diminuem a energia de ativação das reações sem fazerem parte delas, portanto, sem interferirem no equilíbrio químico. A cinética enzimática estuda as reações químicas catalisadas por enzimas, em especial sob o aspecto da velocidade. Em geral, essa velocidade pode ser medida pela quantidade de produto formado ou pelo decréscimo da concentração de substrato por unidade de tempo. Experimentalmente, pode-se observar que a velocidade de uma reação enzimática é proporcional também à concentração da enzima [1].

[1] Velocidade de uma reação enzimática de acordo com a quantidade de enzima (E2= 2E1, E3= 3E1, etc.) As reações enzimáticas ocorrem da seguinte forma:

onde a fase mais lenta, portanto limitante, é a de formação do produto e E=enzima, S=substrato, ES=complexo enzima-substrato, P=produto e k 1, k2 e k3 são as constantes de velocidade das diferentes etapas da reação. Diversos fatores influenciam a atividade enzimática, como por exemplo a temperatura, pH, concentração de substrato ou a presença de inibidores, que são substâncias capazes de diminuir a velocidade da reação. No caso da temperatura e do pH, existem valores chamados ótimos, nos quais a enzima melhor funciona e, portanto, a velocidade é maior. Ultrapassando demasiadamente esses valores, existe o risco de desnaturação da enzima. Alguns microrganismos são capazes de sintetizar enzimas, como é o caso do Saccharomyces cerevisiae, popularmente conhecido como fermento de panificação, que sintetiza a enzima invertase (β-fructofuranosidade). Essa enzima é responsável por catalisar a hidrólise da sacarose em “açúcar invertido”, ou seja, em uma mistura isomolar de seus dois isômeros constituintes: glicose e frutose [2].

2

[2] Hidrólise da sacarose catalisada pela enzima invertase

As condições ótimas específicas da enzima invertase, ou seja, sob as quais seu potencial máximo é atingido, são dadas aos 55ºC em pH 4,6. A reação descrita é muito utilizada na indústria alimentícia, uma vez que a frutose é cerca de 40% mais doce que a sacarose e não cristaliza facilmente, melhorando a textura de doces e sorvetes. É possível obter um extrato não purificado da invertase a partir do fermento, destruindo suas células por autólise e removendo os detritos celulares por centrifugação, após a qual a enzima ficará no líquido sobrenadante.

2. OBJETIVOS 2.1 Estudar as influências da variação da concentração do substrato e da enzima na velocidade da reação enzimática da invertase, bem como a influência da temperatura, variação de pH. 2.2 Examinar as curvas obtidas, calcular alguns parâmetros cinéticos (K M e Vmax) e discutir seus valores e importância.

3

3. MATERIAIS E MÉTODOS Materiais e métodos do experimento A: -

3,5 DNS Tartarato de sódio e potássio Acetato de sódio 20 mM pH 4,8 Sacarose 7 tubos de ensaio

1. Numerar os tubos e adicionar os reagentes segundo a Tabela 1. 2. Após a adição do DNS, colocar os tubos em banho maria por 10 minutos. Depois desse tempo, esfriar em água corrente e adicionar 16 mL de água destilada. Homogeneizar e ler as absorbâncias a 540 nm contra o branco. 3. Construção do gráfico. Tabela 1 Tubos Sol. Pad. Glicose Sol. Tampão Reagente DNS 6mM(mL) (mL) (mL) Branco -------------2,0 2,0 1 0,2 1,8 2,0 2 0,4 1,6 2,0 3 0,6 1,4 2,0 4 0,8 1,2 2,0 5 1,0 1,0 2,0 6 1,0 (amostra 1,0 2,0 desconhecida)

Materiais e métodos do experimento B (Efeito da Concentração de substrato sobre a atividade da enzima): -

Sacarose 5% Solução tampão (acetato de sódio 20 mM pH 4,8) Solução com enzima 1/20 (pH 4,8 [Enzima] = 20 mg/500 mL) 7 tubos de ensaio Gelo Caixa de isopor

1. Enumerar os sete tubos de ensaio, colocar no gelo e adicionar os reagentes segundo a tabela 2 (sendo que a enzima deve ser o último reagente adicionado), deixar os tubos de ensaio na caixa de gelo. 4

2. Agitar o tubo após adicionar a enzima. Levar a caixa de gelo com os tubos até o banho-maria. Colocar os tubos imediatamente em banhomaria a 37 °C por 5 min. Após o decorrer do tempo, os tubos devem retornar imediatamente para o gelo. 3. Ainda no gelo, adicionar 2 ml de DNS a cada tubo. 4. Transferir os tubos imediatamente para banho-maria a 95 °C por 10 min. Findo este tempo, resfriar os tubos em tigela com água temperatura ambiente e adicionar 16 ml de água destilada em cada tubo. Homogeneizar bem por inversão total dos tubos 4 vezes. 5. Ler as absorbâncias a 540 nm contra o branco. 6. Fazer um gráfico da velocidade inicial V0 vs. concentração inicial do substrato (M de sacarose) com os valores obtidos e um gráfico de Lineweaver-Burk e calcular Vmáx e Km.

Tabela 2 Tubos

Sacarose 5% (mL)

Tampão (mL)

Sol. Enzima (1/20) (mL)

Br.

-------------

1.5

0.5

1

0.05

1.45

0.5

2

0.1

1.4

0.5

3

0.3

1.2

0.5

4

0.5

1.0

0.5

5

0.7

0.8

0.5

6

1.0

0.5

0.5

Materiais e métodos do experimento C (Efeitos da concentração de enzima, temperatura e pH na atividade enzimática):      

6 tubos de ensaio Solução de enzima 1/20 Solução de enzima 1/100 Sacarose (5% Solução tampão (acetato de sódio 20 mM pH 4,8) Gelo 5



Caixa de isopor

1. Numerar os tubos e adicionar os reagentes conforme a tabela 3. 2. Os tubos 1-2 são relativos ao efeito da concentração de enzima, os tubos 3-4 são relativos ao efeito da temperatura na atividade enzimática, enquanto que os últimos (5 e 6) são relativos ao efeito do pH 3. Separar 1 mL de amostra de enzima 1/10 num tubo de ensaio (antes de pipetar as soluções), levar a banho maria a 95ºC por 5 min, e colocar de volta no gelo. Esta preparação de enzima aquecida deverá ser utilizada somente no Tubo 3. 4. A reação inteira do tubo 4 deve ser realizada no gelo, nunca tirar do mesmo. 5. Adicionar as enzimas aos respectivos tubos, agitar suavemente. Retirar os tubos Br, 1,2,3 e 5 do gelo (0°C) e colocá-los simultaneamente em banho-maria a 37 °C por 5 min. Decorrido este tempo, os tubos devem retornar imediatamente para o gelo. Espera-se que nesse instante não haja reação significativa. 6. Ainda no gelo, adicionar 2 mL de DNS em todos os tubos. 7. Transferir os tubos para banho-maria a 95 °C por 10 min. Após este tempo, esfriar em tigela com água corrente e adicionar 16 mL de água destilada em cada tubo. Homogeneizar bem por inversão total dos tubos 4x. 8. Ler as absorbâncias a 540 nm contra o branco. 9. Calcular as atividades enzimáticas em Unidades (U) e as atividades específicas das amostras em U/mg.

Tabela 3 Sacarose 5% (mL)

Tampão (mL)

Sol. Enzima (mL)

Br.

-------

1.5

0.5 (1/20)

1

1.0

0.5

0.5 (1/20)

2

1.0

0.5

0.5 (1/100)

3

1.0

0.5

0.5 (1/20 pré-fervida)

Tubos

6

4 (manter no gelo)

1.0

0.5

0.5 (1/20)

5

1.0

0.5 (+ 3 gotas NaOH)

0.5 (1/20)

Materiais e métodos do experimento D (Cálculo da atividade enzimática): 2 tubos de ensaio     

6 tubos de ensaio Biureto Solução de Enzima Proteína BSA Água

1. Adicionar no tubo do branco 2,5 ml de reagente de biureto e 1,5 ml de água; 2. Adicionar no tubo 1 2,5 ml de biureto, 1ml de extrato de levedura e 0,5 ml de água, agitar levemente; 3. Levar em banho-maria a 37ºC por 15 min; 4. Medir a absorbância a 550 nm. 5. Calcular as atividades e as atividades específicas da enzima invertase do extrato de levedura relativa aos tubos 1,2 e 3 da Tabela 3.

4. RESULTADOS E DISCUSSÕES Os resultados do experimento A sobre a dosagem da glicose estão demonstrados na tabela a seguir: Tabela 4 Tubos

Branco 1 2 3

Sol. Pad. Glicose 6mM(mL) -------------0,2 0,4 0,6

Sol. Tampão (mL) 2,0 1,8 1,6 1,4

Reagente DNS (mL)

A540 (nm)

Glicose (µ mol/L)

2,0 2,0 2,0 2,0

0 0,053 0,148 0,213

0 60 120 180 7

4 5 6

0,8 1,2 1,0 1,0 1,0 (amostra 1,0 desconhecida)

2,0 2,0 2,0

0,296 0,396 0,114

240 330 94,62

Os valores da concentração de glicose foram obtidos da seguinte forma: C1V1=C2V2 Em que C1= concentração da glicose não diluída da solução (6 mM); V1= volume utilizado no tubo (no caso o tubo 1) que é 0.2 mL; E V2= 20mL (0,2 mL + 1,8 mL do tampão + 2,0 mL do DNS) No caso do tubo 1: 6.0,2 = C2.20 C2 = 0,06 mM ou 60 uM Tubo 2: 6.0,4 = C2.20 C2 = 120 uM Tubo 3: 6.0,6 = C2.20 C2 = 180 uM Tubo 4: 6.0,8 = C2.20 C2 = 240 uM Tubo 5: 6.1 = C2.20 C2 = 330 uM Para descobrir o valor da concentração do tubo 6 é necessário o valor da absorbância que foi obtido através da espectrofotometria para a dosagem e o fator, pois não existem os dados da concentração da amostra desconhecida utilizada no experimento. Para o gráfico a concentração de glicose foi utilizada como eixo x, e a absorbância como eixo y, como demonstrado abaixo:

8

Sendo a concentração do tubo 6 [ ] = F. abs temos: F=830, pois, ∆x 100−50 F= F= ∆y 0,120−0,06 F=830 Logo: [Glicose]=830.0,114 [Glicose]=94,62umol/L=0,09462 m Considerando que a glicose foi diluída durante todo o processo teremos: C1V1=C2V2 C1.1=0,9465.20 A concentração da amostra desconhecida então foi de: C1=1,893 mM Os resultados do experimento B estão demonstrados a seguir na tabela: 9

Tabela 5

Tubo s

Sacarose 5% (mL)

[Sacarose ]

Tampã o (mL)

Sol. Enzima (1/20) (mL)

A540

[Glicose]

V0

(nm)

(uM)

Sacarose Hidrol (umol/min)

(uM)

Br.

-------------

0

1.5

0.5

0

0

0

1

0.05

3650

1.45

0.5

0,127

1,0541

0,0042164

2

0.1

7300

1.4

0.5

0,236

1,9588

0,0078354

3

0.3

21900

1.2

0.5

0,463

3,8429

0,0153716

4

0.5

36500

1.0

0.5

0,565

4,6895

0,018758

5

0.7

51000

0.8

0.5

0,634

5,6772

0,0227088

6

1.0

73000

0.5

0.5

0,735

6,1005

0,024402

O experimento realizado tem a função de analisar a cinética da enzima utilizada, quantificando a velocidade e a concentração inicial com um gráfico simples e também calcular o valor da V máx e Km da sacarose para que possamos compreender melhor de que forma aconteceu a reação com a enzima. Para obter a concentração da sacarose descrita na tabela usaremos: C1V1=C2V2 Entretanto, para obter o valor de C1 temos: 5g  100 mL X  1000 mL X= 50 g/L C= M(mol/L).M(g/mol) 50= M. 342,24 M= 0,146 mol/L M= 146 mmol/l Para o Tubo 1: C1V1=C2V2 10

146.0,05= C2.20 C2= 0,365 Mm C2= 3650 uM Tubo 2: 146.0,1= C2.20 C2=7300 uM Tubo 3: 146.0,3 = C2.20 C2=21900 uM

Tubo 4: 146.0,5 = C2.20 C2=36500 uM Tubo 5: 146.0,7 = C2.20 C2=51100 uM Tubo 6: 146.1 = C2.20 C2=73000 uM

Para obter a concentração da glicose descrita na tabela foi feito utilizando os seguintes dados: F= 830 (da quantificação da glicose no experimento A) Absorbância obtida na espectrofotometria. [glicose]=F. Abs.10 Tubo 1: [glicose]=830.0,127.10=1054,1 mM, transformado em uM= 1,0541uM Tubo 2: [glicose]=830.0,236.10=1,9588 uM Tubo 3: [glicose] =830.0,463.10= 3,8429 uM 11

Tubo 4: [glicose] =830.0,565.10= 4,6895 uM Tubo 5: [glicose]=830.0,684.10=5,6772 uM Tubo 6: [glicose]=830.0,735.10= 6,1005 uM

Para a velocidade inicial da sacarose (V0 Sacarose hidrol.) em umol/min temos: Tubo 1: 1,0541  1000 mL (1 L) X umol  20 mL (0,02 L) X= 0,021082 ÷ 5 min = 0,0042164 umol/min Tubo 2: 1,9588  1000 mL (1 L) X umol  20 mL (0,02 L) X= 0,039176 ÷ 5 min = 0,0078352 umol/min Tubo 3: 3,8429  1000 mL (1 L) X umol  20 mL (0,02 L) X= 0,076858 ÷ 5 min = 0,0153716 umol/min Tubo 4: 4,6895  1000 mL (1 L) X umol  20 mL (0,02 L) X= 0,09379 ÷ 5 min = 0,018758 umol/min Tubo 5: 5,6772  1000 mL (1 L) X umol  20 mL (0,02 L) X= 0,113544 ÷ 5 min = 0,0227088 umol/min Tubo 6: 6,1005  1000 mL (1 L) X umol  20 mL (0,02 L) 12

X= 0,12201 ÷ 5 min = 0,024402 umol/min

Agora com dados suficientes é possível montar os gráficos a seguir:

13

Após montar os gráficos, foi utilizada a equação da reta. Com a equação da reta, substituímos o y pelo 0: Y = 747348x + 30,264 0 = 747348x + 30,264 - 30,264 = 747348x - 30,264/747376,264 = X X= - 0,0004048; Y= 0; -1/KM = X -1/KM = - 0,0004048 KM = -1/-0,0004048 KM = 2470,355/2 Km = 1235,178 Isso acontece porque a estequiometria da reação é de 1 mol de sacarose para 1 mol de glicose e 1 mol de frutose. Como tanto a glicose quanto a frutose são redutoras, diferentemente da sacarose que não é redutora, as duas serão lidas pelo espectrofotômetro. Ocorrendo basicamente assim: Sacarose+ H2O invertase→ glicose + frutose O KM é a concentração de substrato onde a velocidade da reação é a metade da velocidade máxima. Ele é utilizado para medir a afinidade de uma enzima pelo substrato, também sendo um parâmetro para a comparação de isoenzimas, O KM é também utilizado como um dos fatores para se conseguir medir a Vmáx, utilizando da seguinte forma: m = Km/ Vmáx, onde: m: coeficiente angular (valor estabelecido anteriormente como 747348); 14

Km: 1235,178. 747348 = 1235,178/ Vmáx Vmáx= 1235,178/747348 Vmáx= 0,0016536

Após todos esses resultados nós podemos perceber e analisar os efeitos da concentração do substrato na atividade enzimática. A variação de concentração do substrato pôde nos informar quando a atividade enzimática já está saturada. No caso do gráfico apresentado é possível ver que a atividade enzimática começa a ficar saturada quando a concentração da glicose chega a 65000 uM, onde ela diminui a velocidade do seu crescimento até então exponencial para se aproximar de uma constante, se mantendo ali próximo da velocidade inicial da sacarose hidrolisada de 0,024 umol/min. A saturação acontece porque todos os sítios ativos estão ocupados pelas moléculas do substrato ou do produto formado com a reação da atividade desta enzima. Em condições normais e dentro de um organismo podemos imaginar que as enzimas não podem ficar saturadas por completo, pois assim ela não poderia reagir de forma necessária para a catalise de certas substâncias, já que elas são imprescindíveis para tal reação. Logo, podemos concluir e observar que é muito influente a concentração do substrato na velocidade de uma reação enzimática, determinando quando ela irá ser mais rápida e o seu nível de saturação. Como forma de analisar os efeitos da concentração de enzima, temperatura e pH na atividade enzimática, foram numerados 6 tubos e adicionados os reagentes conforme a tabela a seguir: Tabela 3 Sacaros e 5% (mL)

Tampão (mL)

Sol. Enzima (mL)

A 540 (nm)

Vo Sacarose Hidrol (umol/min)

Br.

-------

1.5

0.5 (1/20)

0

0

1

1.0

0.5

0.5 (1/20)

1,390

46,148

2

1.0

0.5

0.5 (1/100)

0,350

11,62

3

1.0

0.5

0.5 (1/20 préfervida)

0,001

0,0332

4

1.0

0.5

0.5 (1/20)

0,155

5,146

Tubos

15

(manter no gelo) 5

1.0

0.5 (+ 3 gotas NaOH)

0.5 (1/20)

0,151

5,0132

Para que fosse possível fazer a análise posterior dos resultados, foi necessário levar a banhomaria a 95°C por 5 minutos 1 mL de amostra de enzima 1/20, afim de comparar os resultados em um tubo no qual a enzima foi pré-fervida e, portanto, teve sua estrutura modificada. Como forma de comparar os tubos 1-2 com seus respectivos efeitos de concentração de enzima, 3-4 de temperatura na atividade enzimática e por último do pH no tubo 5, foi necessário comparar os valores da Velocidade inicial de sacarose hidrolisada (umol/min), obtidos através dos valores de absorbância. Tais valores foram constatados transcorridos 5 minutos de banhomaria a 37°C nos tubos Br,1,2,3 e 5 transcorrido esse tempo ao retorno imediato para o gelo, além da adição de 2 mL de DNS em todos os tubos, da transferência dos tubos para banho-maria a 95°C por 10 minutos e, finalmente da adição de 16 mL de água destilada em cada tubo. Os valores foram anotados na tabela acima. Para o cálculo da Vo, foi necessário fazer para cada tubo a seguinte relção: Vo= F.Abs.10.0,02 , sendo F=830 adotado pelo 5 experimento 1. Para o tubo branco: 830.0.10.0,02/5 ; Vo=0 Para o tubo 1: 830.1,390.10.0,02/5 ; Vo=46,148 Para o tubo 2: 830.0,350.10.0,02/5 ; Vo=11,62 Para o tubo 3: 830.0,001.10.0,02/5 ; Vo=0,0332 Para o tubo 4: 830.0,155.10.0,02/5 ; Vo=5,146 Para o tubo 5: 830.0,151.10.0,02/5 ; Vo=5,0132 Como no tubo branco não foi adicionado o substrato sacarose, não ocorreu a conversão para glicose + frutose, como ocorreu nos outros tubos, fato que determina a quantificação do carboidrato pela adição do DNS, seguido da espectrofotogametria, sendo a Vo correspondente à 0.

16

Como em todos outros tubos foi adicionado sacarose 5%, 1mL em cada, a reação C12H22O11 +H20 C 6H12O6 + C6H12O6 ocorreu, e a quantificação da glicose foi observada. Comparando os tubos 1-2, nota-se que a velocidade foi maior no tubo 1, onde a concentração da enzima invertase era maior que no tubo 2 (1/20 > 1/100). Portanto, com uma maior concentração de enzima, menor o tempo em que a reação ocorre e mais rápida ela será. Comparando os tubos 3-4 ao que diz respeito à temperatura, o 4, que teve todas as etapas realizadas no gelo, obteve Vo maior, visto que a enzima no tubo 3 foi desnaturada pelo aquecimento condicionado, não tendo influencia significativa na velocidade (se comprado ao tudo branco, os valores são muito próximos). Com o aumento da temperatura, a energia térmica aumenta e consequentemente também, a frequência de choques entre as moléculas por unidade de tempo. No entanto, a velocidade tende a dimunuir no momento em que ocorre a desnaturação (em torno dos 40°C) e esse padrão não pode ser mais visualizado. Ao final, observando o valor obtido no tubo 5 e comparando com o tubo 1 por possuírem as mesmas condições de concentração de sacarose, tampão e solução enzimática, nota-se qu...