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Repaso I Microbiología Prof. Carlos Minguela I.

II.

Macromoléculas y genes • Macromoléculas informacionales – almacenamiento de información de cómo funciona el organismo o RNA (reflejo del ADN) o DNA o Proteínas • ADN ! cromosoma ! plásmido ! transposones • Hay que purificar el ADN: ver nucleótidos – base nitrogenada • Formato FASTA – archivo de texto que contiene una lectura de secuenciación (universal) o (>) – indica que desde aquí hay algo que se debe analizar o texto se trabaja en un editor de texto • Marco abierto de lectura – donde se puede leer el ADN en forma de

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codones o Se puede empezar a leer codones en diferentes partes del “DNA strand” BLAST – base de datos, se usa para identificar data o Query: secuencia desconocida o Subject: secuencia que se parece en base de datos o Identities: cuánto fue idéntico (entre tu secuencia y la de la base

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de datos) Información adicional: penicilina – beta lactam o Bacterias beta-lactamasa degeneran la penicilina

Expresión de genes • Dogma central de la vida

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Ribosoma se compone de o Proteínas ribosomales o rRNA En algunos casos no es necesario convertir un RNA a proteína en algunos casos; las funciones se pueden llevar a cabo en forma de RNA

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o 3.23 millones de pb o 23,000 genes se pueden codificar para una proteína o El 98% del genoma humano no codifica

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Tipos de RNA o RNA regulador ▪ miRNA – microRNA (apróx. 20b) ∴ complementario al mRNA, hebra doble de RNA que no se puede transcribir a una proteína

∴ el ribosoma no puede leer la sección con miRNA, ocurre traducción parcial; no se completa la síntesis de la proteína ▪ siRNA – small interferring RNA ∴ se ven más comúnmente en las plantas

∴ hebra doble – en las plantas es indicativo de virus, se trata de degradar; hay proteínas que las reconocen y degradan el mRNA entero, no se produce el producto

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∴ diferencias de siRNA y miRNA – miRNA la traducción ocurre hasta cierto punto, siRNA el ribosoma no llega a traducir nada o RNA estructural ▪ rRNA – RNA ribosomal ∴ esqueleto, pone las bases para que surja un ribosoma funcional o RNA catalítico ▪ rRNA – cataliza la síntesis de la proteína (forma el enlace péptido) ▪ RNAsa P – proteína que no funciona sin un componente de RNA (cofactor) ∴ Forma tRNA (RNA de transferencia)

 ▪ tRNA – suple y acarrea aminoácidos para los ribosomas ▪ snRNA – small nuclear RNA, procesa el mRNA

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 ∴ snRNA reconoce dónde comienza y dónde termina el intrón ∴ Splicing – remover intrones (regiones no codificantes para proteínas) ∴ Spliceosome – snRNA + proteínas Elementos genéticos – moléculas que contienen muchos genes de DNA o Transposones: más pequeños que un plásmido, se mueven de un lado a otro dentro del plásmido o cromosoma; pueden mover ADN de regiones que los rodean de un lado a otro cuando se transportan

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Información adicional – E. Coli tiene aproximadamente 4.5 millones pb o Compacta los pares de base con ayuda de las enzimas ▪ DNA girasa (Topoisomerasa II) ∴ Corta ambas hebras, las envuelve y conecta un end con el otro

 ▪ DNA binding proteins – evitan que se suelte la polimerasa ▪ DNA Topoisomerasa I ∴ El número indica cuántas veces corta ∴ Libera tensión (opuesto a la II) para que se pueda leer la hebra sencilla en transcripción/replicación III. Replicación de bacterias • Cromosomas bacterianos son mayormente circulares, existen lineales • Nucleoide – similar al núcleo, región de material genético de la bacteria (se necesita un microscopio electrónico para verlo; zona densa) • Se forma una theta y comienza en el Origen de Replicación (lugar único en las bacterias; contiene características importantes)

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

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Otra información – epigenetics: estudia cómo el estado de condensación del ADN influencia en su expresión Eucariotas tienen múltiples orígenes de replicación – tienen en común las múltiples bases A y T que son fáciles de desnaturalizar Replicación es bidireccional Componentes del replisoma (proteínas encargadas de replicación) o DNA helicasa – estructura de nivel cuaternario, expande las hebras para proveer ADN de hebra sencilla; primera que entra en acción o DNA primasa – se coloca en el DNA de hebra sencilla y construye una secuencia complementaria de RNA (cebador que provee dirección y localización, bien corto)

o DNA polimerasa III – una unidad de DNA pol III por hebra, polimeriza segmentos grandes de ADN; número romano es alusivo al orden en que se descubrieron las pol de E. Coli; ambas unidades deben estar alineadas o Subunidad Tau – alinea ambas subunidades de la DNA pol III o Sliding clamp (brazadera de desplazamiento) – hala la hebra de ADN para que se pueda leer (1,000 nucleótidos por segundo se leen por DNA pol III)

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o Single-strand DNA binding proteins – forran las hebras para que no puedan volver a formar los enlaces de H y puedan ser leídas por DNA pol III o DNA girasa – impide que se detenga el “replication fork”, elimina los nudos en las hebras formados por la helicasa o DNA polimerasa I – remueve el primer de RNA y lo reemplaza con ADN, une la misma hebra con un enlace fosfodiéster (donde estaba el fragmento de Ogazaki) o DNA polimersa II – trabaja cuando el ADN se corrompe o daña por UV u oxigenación (moléculas que se comportan como radicales libres buscando electrones dañan el DNA/proteínas [cadenas laterales de los aminoácidos, las proteínas pierden función]) o Proof-reading protein – se asegura de que DNA pol III ponga y replique la secuencia correcta. Cuando el DNA está muy dañado por errores, el proof-reading protein no funciona bien y el DNA III se tranca ▪ Genes de producir pol III paran de funcionar y entra en juego pol II (no tiene mecanismo de corrección, baja fidelidad. Es buena para estas situaciones porque no para cuando el ADN está muy dañado). El producto es un ADN mutado

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Aplicaciones de replicación o PCR: Polymerase Chain Reaction, copias de genes en específico ▪ Kary Mullis optimizó el proceso que ya existía en los 70’s pero era muy rudimentario ▪ Termociclador (cambios en temperatura reemplazan las proteínas) ▪ La única proteína necesaria es DNA pol III ▪ Los primers especifican en qué área del DNA se quiere enfocar (región de interés) ▪ ¿Qué indica que el PCR fue exitoso? ∴ Ondas de espectrometría de 260nm ❖ Tinte emite largo de onda para localizar el DNA (color anaranjado) al recibir ondas UV ∴ Gel de agarosa (electroforesis)

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❖ Se usa un marcador para dejarse llevar por los patrones de banda ❖ Se debe saber desde antes el tamaño del gen que quieres amplificar ▪ ¿Para qué sirve el PCR? ∴ Se necesita más de una molécula de ADN para trabajarla bien. Se puede medir en términos de masa ∴ Se puede hacer secuenciación, ingeniería genética… ∴ Vector – sirve como una “pinza” de DNA, atrapa el DNA (producto de PCR). Forma una molécula de DNA recombinante (transformación) ▪ Se pueden diseñar primers para distintos genes del humano y usarlos para: ∴ Forensics ∴ Diagnosis de diseases ∴ Expresión genética ❖ Qué genes se están usando/sintetizando a proteínas ▪ Thomas Brock – escritor del libro, aisló microorganismos que crecen en ambientes de 50-80° C ∴ Thermus aquaticus – bacteria termofílica usada en el PCR (su DNA pol es resistente a los cambios de temperatura) ▪ PCR a microbiología ∴ Se puede estudiar microbiología sin el uso de técnicas de cultivo, que pueden ser afectadas por factores como ❖ Sesgo de enriquecimiento – se provee una alimentació a los microorganismos que es limitada y no favorece a todos ∴ Se extrae DNA y al hacer PCR los primers de células abundantes tienen más lugares de anclaje y dan más copias del ADN que aquellas células que

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hay en pocas cantidades ▪ Para diseñar un primer en específico, alguien debe haber secuenciado el gen que vas a amplificar Hay antibióticos que pueden anular el mecanismo de replicación

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o Cipoflaxina – inhibe la actividad de la Topoisomerasa II (girasa) y de la Topoisomerasa IV (separa los cromosomas, hace cortes) IV. Transcripción en las bacterias • DNA ! RNA o mRNA (codifica para una proteína) o tRNA (aminoácidos al ribosoma) o rRNA (estructural) o sRNA (small RNA) ▪ miRNA ▪ siRNA ▪ sRNA ∴ presentes en bacterias y arqueas ∴ función reguladora parecida a las dos anteriores • Importantes en bacterias y en arqueas • Arqueas también pueden tener su ADN regulado • Genes informacionales – importantes para taxonomía, implicados en

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funciones vitales, replicación de DNA, transcripción (síntesis de RNA), traducción o Ej. pedazo de DNA que codifica para la polimerasa o alguna parte de ella Ribosoma cataliza la síntesis de DNA a proteína (no es una enzima) o Genes de DNA ribosomal también se usan como marcadores taxonómicos (de los más que se usan para la identificación) Genes informacionales son necesarios para la vida Ambiente de RNA polimerasa Transcription terminator

ORF DNA codificante para una proteinna

Stop Codon

S.D. o (-10) – (-35) – región promotora, donde la RNA polimerasa hace contacto para poder transcribir o +1 – inicio de la transcripción o Shine-Dalgarno – secuencia de bases para la unión del ribosoma GABRIELA 9

o Open Reading Frame – marco abierto de lectura que codifica para una proteína; comienza con el codón AUG (f-met) y termina con un stop codón o Factor sigma – ayuda a la RNA polimerasa a encontrar el

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promotor (es una proteína que se une a la RNA pol); se adhiere al promotor y a este entonces se le adhiere la RNA polimerasa Todo esto está codificado a nivel de ADN; mRNA queda sin el promotor pero con todo lo demás Metionina – starter aminoacid o Proteína bacteriana comienza con formil-metionina (solo en la del comienzo Al abrir la doble hebra de ADN se van añadiendo “ribonucleosides triphosphates” al 3’ OH Se lee de 3’ ! 5’ para fabricar de 5’ ! 3’ Terminación de transcripción o RHO factor: RNA polimerasa se torna lenta al final de la transcripción, RHO factor (6 piezas o hexadímero) la espera y la detiene. Necesita ATP para funcionar ▪ Se desliza por el mRNA al hidrolizar ATP hasta llegar a la RNA polimerasa lenta y despegarla o Mecanismo intrínseco: no depende de intervención externa; hay

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un segmento de residuos de timina al final de la hebra de DNA que al ser repetitivas e invertidas tornan a la RNA pol lenta; se forma un loop para terminar la transcripción Comparaciones

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Bacterias

Eucariotas

Un solo tipo de RNA polimerasa que responde a promotores de – mRNA, tRNA, rRNA

Tres tipos de RNA polimerasa: 1. RNA pol I – rRNA 2. RNA pol II – mRNA, snRNA 3. RNA pol III - tRNA

Requiere una sola proteína para acomodar al promotor

Muchas proteínas para encontrar al promotor y hay control más fino de la RNA pol

Menos control y menos velocidad

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Cola de aminoácidos repetitiva aumenta la velocidad – control más fijo de la actividad de la polimerasa eucariota

Arqueas o Solo usa una RNA polimerasa parecida a la RNA pol II de los eucariotas o Su promotor tiene un TATA box (como los eucariotas) que ancla al TBP (Tata Binding Protein) o Secuencia BRE en el promotor (B Recognition Element) – un lugar de unión para la proteína “Factor de Transcripción B” o Necesita que el TBP y el TFB estén para poder anclar a la RNA polimerasa Información extra: rifampicina o Inhibe la RNA polimerasa bacteriana pero no la eucariota, se usa para tratamiento de: ▪ Tuberculosis ▪ Leve meningitis (para el fuerte se usa beta-lactam) o RNA polimerasa bacteriana mutada no deja que el antibiótico se una a ella Operones o Formato para organizar genes y regularlos o En general bacterianos y en arqueas, rara la vez en eucariotas o Permite la expresión y regulación simultánea de varios genes o Operón de lactosa – contiene genes para degradación de lactosa (azúcar – galactosa + glucosa, leche)

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▪ CAP site – lugar de unión para proteína “Catabolite Activator Protein” ▪ Operador – lugar de unión para un represor (represor bloquea el paso de la RNA polimerasa) ▪ Lac Y – lactose permease (importa/transporta lactosa) ▪ Lac Z – beta galactosidasa (breaks down lactose – galactosa + glucosa) ▪ Lac A – acetila las beta galactosidadas ▪ Lac I – codifica para el represor, gen constitutivo o Función – optimizar la expresión ▪ Si gen A, B y C se usan para la misma cosa, es mejor tener un solo promotor para los tres o Glucosa es la primera fuente de energía del ser vivo

ATP

▪ Demanda de energía es suplida por la glucosa cAMP

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Glucólisis

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▪ Relación – si hay mucha glucosa, hay pocos cAMP porque estos están haciendo glucólisis para producir mas ATP; si hay poca glucosa o no hay, se siguen produciendo cAMPs pero estos se quedan sin hacer glucólisis Si hay mucho cAMP, la proteína CAP tiene más probabilidad de atraparlos en su sitio activo y cuando esto sucede, la proteína cambia de forma y puede unirse a la sección promotora ▪ Acondiciona el área promotora para que la RNA polimerasa se adhiera cAMP-CAP complex se adhieren, se adhiere la polimerasa pero no puede trabajar por el represor Deben suficientes cantidades de lactosa para que una enzima las convierta en alolactosa; la alolactosa se adhiere al represor y lo remueve del ADN, al remover el represor ahí puede trabajar la RNA polimerasa ▪ Producto: mRNA policistrónico (tiene muchos mensajes – para hacer proteínas lacY, lacA y lacZ) ∴ Tiene más de un RBS (Ribosome Binding Site) ❖ Varios ribosomas trabajan a la vez, uno en cada binding site ∴ Si solo hubiese un RBS se crearía una proteína aberrante ¿Por qué se prefiere usar la glucosa como fuente de energía? Genes de glucólisis son constitutivos; lactosa se tiene que procesar antes de convertirla en energía Curva de crecimiento – log # de células vs tiempo ▪ Número de células se puede calcular a través de espectrofotometría o muestras de dilución en serie

∴ Fase lag – todavía no hay crecimiento ∴ Fase log/exponencial – crecimiento logarítmico ∴ Fase estacionaria – por cada organismo que se duplica, uno se muere (escases de nutrientes) ∴ Fase de muerte – se acaban todos los nutrientes, todas mueren " V.

Importancia del rRNA • Carl Woese – en los 1970s descubre que la secuencia de las moléculas de rRNA y sus genes se pueden usar para inferir relaciones evolutivas entre organismos o Descubrió organismos procariotas metanogénicos (producen metano) que eran sumamente diferentes a las bacterias, los llamo Archaea (a través de los SSU rRNA) • ¿Por qué es bueno el rRNA? o Distribuido universalmente o Funcionalmente constantes o Cambian lentamente o Largo adecuado para proveer una buena vista de las relaciones evolutivas • Análisis filogenético – relaciones entre bacterias o Se detectan genes por PCR, se secuencia el ADN para saber el orden de las bases, se consulta la base de datos para identificar la secuencia (alineando secuencias), análisis filogenético traduce el análisis de secuencias similares y produce una hipótesis sobre cómo un organismo fue evolucionando a otros o En el análisis, regiones con diferencias no aparecen

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o M6 sequence analizer – puntos marcan las idénticas, letras dejan saber diferencias o Mientras más cortas las distancias entre ramas (dentro del árbol filogenético), más relacionadas LUCA – Last Universal Common Ancestor Bases de datos: números que parecen tablillas son los números de identidad para buscar estos genes en GeneBank o en NCBI (específicamente nucleótidos) Gram + tiñe violeta, Gram – tiñe rojo

o No todas las bacterias caen dentro de Gram (-) o Gram (+), y estas entre sí no necesariamente se relacionan o Una Gram (-) y otra pueden ser morfológicamente parecidas pero genéticamente distintas Los organismos que mayormente causan infecciones severas son Gram (-) y entéticas (bacterias con nicho en el estómago) o Proteobacterias (Gamma, Beta, Alpha, Delta, Epsilon) Gram (+) o Firmicutes (menos contenido de Guanina y Citosina) ▪ Bacillus o Actinobacterias (otro linaje)

VI. Traducción • Estructura del ribosoma microbiano o #S – la S indica el tamaño del ribosoma en unidades Svedberg

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▪ Medida de tamaño de partículas basado en la velocidad con la que viaja cuando se expone a fuerza-g alta en un tubo lleno de una solución viscosa (“sucrose gradient”) ∴ Vierte cierto volumen de sucrosa en un tubo ∴ Se vierte otro volumen de sucrosa con menor concentración ∴ Se repite dos veces ❖ Las diferentes capas tendrán diferentes densidades – diferentes rRNAs se pueden separar por tamaño en la centrifugación ▪ 50S = 5S y 23S rRNA, 31 proteínas ▪ 30S = 16S rRNA y 21 proteínas ∴ Proteínas dan forma y función, rRNA da estructura ▪ 30S + 50S = 70S o rRNA tiene estructura a nivel secundario ya que como es una hebra sencilla se dobla entre si formando puentes de hidrógenos con cualquier base que sea complementaria ▪ Esto forma regiones conservadas y variables ∴ Las proteínas se pegan a los pedazos no variables ya que son los que no cambian y siempre serán iguales para todas ∴ Alpha hélice ocurre en estas secciones ▪ Las mutaciones ocurren en los espacios variables porque son los que pueden tener cambios frecuentes (le dan singularidad) (hay pocas partes variables) o Ribosoma

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▪ UCCU – secuencia de bases, aquí ocurre la unión de mRNA (extremo 3’), es complementario al Shine-Dalgario (AGGA) ▪ A site – a donde se llevan los aminoácidos que se van a unir a la cadena ▪ P site – tRNA aguanta la cadena de aminoácidos que se está sintetizando ▪ E site – tRNA vacío se sale por aquí ▪ Exit tunnel – túnel por donde salen los polipéptidos •

tRNA o Tiene un anticodón complementario a una secuencia (codón) que se encuentra en el mRNA o Aminoacyl tRNA sintetaza – encargada de reconocer que tipo de tRNA es y cuál aminoácido debe llevar, y se lo provee ▪ Mide el anticodón ▪ Síntesis de tRNA es catalizado por la enzima específica para cada tipo de tRNA ▪ Usa AMP

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