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Práctica micro biología de pruebas bioquímicas...

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INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL Unidad Profesional Interdisciplinaria de Ingeniería Campus Guanajuato

Laboratorio de Microbiología Farmacéutica

Practica No. 7: Pruebas bioquímicas para identificar bacterias 3FM2 Equipo 3: Segura Martínez Lucero Bermúdez Ruíz Jessica Guadalupe Lisea Zamarripa José María Herrera Olaez Brayam David

Profesor: M. en C. Anastasio Cortés Mendoza

Contenido Resultados............................................................................................................................................................................. 3 Identificación de las bacterias ........................................................................................................................................ 3 Tinción Gram................................................................................................................................................................. 3 Prueba de hidrólisis del almidón .................................................................................................................................... 5 Prueba de rojo de metilo ................................................................................................................................................. 5 Prueba en agar triple azúcar y hierro (TSI).................................................................................................................. 6 Desaminación y descarboxilación de aminoácidos en medio LIA............................................................................ 6 Prueba en medio MIO (indol) ......................................................................................................................................... 7 Prueba de citrato de Simmons ....................................................................................................................................... 7 Prueba de urea ................................................................................................................................................................. 8 Prueba de la producción de catalasa ............................................................................................................................ 8 Discusiones ........................................................................................................................................................................... 9 Conclusiones....................................................................................................................................................................... 10 Referencias ......................................................................................................................................................................... 10

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Resultados Identificación de las bacterias Tinción Gram Tabla 1. Resultados de Tinción de Gram con vistas al microscopio.

Bacteria Medio de cultivo B. subtilis Agar

almidón

Observación

Con un aumento de 100x se alcanza a observar bacilos con tinción Gram positiva.

Enterobacter Agar

La morfología observable con aumento de 100x es cocobacilos, y la tinción no se logra diferenciar del todo bien, pero predomina una coloración rojiza, por lo que podría ser negativa.

Contaminado Agar

Con un aumento del 100x, en esta muestra se obtienen dos distinatas morfologías microscópicas: bacilos y cocos, al igual que se presentan ambas tinciones, negativas y positivas.

almidón

nutritivo

Imagen

Continúa

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Tabla 1. Resultados de Tinción de Gram con vistas al microscopio. (Continuación) En un aumento de Muestra Agar nutritivo 100x es posible problema reconocer la morfología en forma de bacilo con tinción Gram positiva.

Salmonella Agar

almidón

La imagen presentada con aumento del 100x tiene morfología microscópica de bacilo y Gram (-).

Proteus Agar mirabilis almidón

Aunque el aumento es del 100x no es posible describir una morfología exacta, pero se alcanza a observar cocos con una tinción de color púrpura, cabe mencionar que el lente se encontraba sucio.

Agar almidón

Con aumento de 100x se observa una morfología de bacilo con tinción Gram negativa.

E. coli

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Prueba de hidrólisis del almidón Tabla 2. Resultados de la prueba de hidrólisis del almidón.

Imagen

B. subtilis Bacteria Observaciones Positiv , se observó, a

contra luz, halo alrededor de la estría.

E. Coli Negativo, no se observó halo alrededor de la estría.

P. mirabilis Positivo, se observó, a contra luz, halo alrededor de la estría.

Imagen

Salmonella Bacteria Observaciones Positivo, se observó, a

contra luz, halo alrededor de la estría.

Enterobacter Positivo, se observó, a contra luz, halo alrededor de la estría

Prueba de rojo de metilo Tabla 3. Resultados de prueba de rojo de metilo. P.mirabillis (A y B), E.coli (C), S. aureus (D) y Salmonella(E).

A B

C

D

E

Tubo (A y B): presentó turbidez y una coloración amarillo pálido. Tubo (C): presentó turbidez y una coloración amarillo pálido. Tubo (D): presentó turbidez y una coloración amarillo pálido. Tubo (E): presentó turbidez y una coloración amarillo pálido.

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Prueba en agar triple azúcar y hierro (TSI). Tabla 4. Resultados de prueba en medio TSI.

Bacteria B. subtilis

Muestra Problema

Cosméticos

E. coli

De naranja a amarillo, prueba positiva, con pH ácido.

De naranja a amarillo más oscuro que los demás tubos, prueba positiva, con pH ácido.

De naranja a amarillo, prueba positiva, con pH ácido. Con burbujas y líquido dentro del medio.

Imagen

Observación De naranja a

amarillo, prueba positiva, con pH ácido.

Desaminación y descarboxilación de aminoácidos en medio LIA Tabla 5. Resultados de prueba con medio LIA. BACTERIA IMAGEN

SALMONELLA

ENTEROBACTER

P. MIRABILIS

OBSERVACIÓN

Color negro en la parte inoculada, prueba positiva para descarboxilación de aminoácidos

Crecimiento en la estriada, se observa turbidez, pero no hay gran cambio de coloración.

Se observaron burbujas y color amarillo en la base del tubo y rojizo en el pico de flauta, con líquido en el tubo. Positiva para desaminación de aminoácidos.

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Prueba en medio MIO (indol) Tabla 6. Resultados de prueba en medio MIO. P. mirabilis (A y B), B.subtillis (C), E.coli(D) y Salmonella(E).

A

B

C

D

E

Tubo (A y B): Presentó tres colores distintos: café-purpura (capa superior), amarillo (intermedio), purpura(fondo). Además, presentó turbidez y crecimiento de colonias en demasía. Tubo (C): presento tres colores distintos: café-purpura (capa superior), amarillo (intermedio), purpura(fondo). Además, presentó burbujas, turbidez y crecimiento de colonias normal. Tubo (D): presento tres colores distintos: rojo (capa superior), amarillo (intermedio), cafépurpura (fondo). Además, presentó turbidez y crecimiento de colonias normal. Tubo (E): presento una coloración purpura, turbidez y crecimiento normal.

Prueba de citrato de Simmons Tabla 7. Resultados de prueba en medio de citrato de Simmons.

Microorganismo Salmonella

Contaminación Muestra E. coli problema

Cosmético

Verde más oscuro.

Agua en el tubo.

Imagen

Observación Inoculo verde limón. De verde pasto pasó a azul petróleo.

Coloración azul petróleo.

Poco más turbio, agua en el medio.

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Prueba de urea Tabla 8. Resultados de prueba en caldo de urea.

Microorganismo P. mirabilis Imagen

Observación Rosa.

Muestra Contaminación Staphylococcus problema aureus

Sin cambio.

Sin cambio.

Sin cambio.

Prueba de la producción de catalasa Tabla 9. Resultados de la prueba de la producción de catalasa.

Bacteria P. mirabilis

Staphylococcus aureus

M.P

contaminación

Presentó formación de burbujas E.coli

No presentó burbujas

No presentó burbujas

Salmonella

Enterobacter

No presento burbujas

No presentó burbujas

No presentó burbujas

Imagen

Observación No presentó burbujas Bacteria B. subtillis

Imagen

Observación Presentó formación de burbujas

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Discusiones Identificación de las bacterias Las tinciones realizadas fueron sobre algunas especies de la familia Enterobacteriaceae, como E. coli, Salmonella, Enterobacter y Proteus mirabilis, la otra bacteria fue Bacillus subtilis. Que de acuerdo a Merino (s. f.), la familia Enterobacteriaceae está formada por bacilos y cocobacilos gramnegativos, por lo que las tinciones salieron adecuadamente, con excepción de P. mirabilis, igualmente hay sospechas sobre la Enterobacter, ya que su morfología no está del todo definida y debería ser en forma de bacilos, estos errores se deben a una mala tinción o mal enfoque en el microscopio (Mayaguez,2001). Para el B. subtilis la tinción fue la correcta, pues es una bacteria Gram positiva (Madigan. 2005). Prueba de hidrólisis del almidón La Tabla 2 muestra las pruebas positivas de esta prueba, donde el proceso se puede observar cómo cambió de un color azul intenso a purpura y luego a una falta de color pues se estaba hidrolizando el almidón, además que presentaron áreas incoloras (zona de hidrólisis) alrededor del crecimiento, por lo que respecta a la E. coli, no había este halo claro alrededor de la estría, por lo que fue negativa. (McFaddin,2003) Prueba de rojo de metilo Para la prueba de rojo de fenol, de acuerdo a McFaddin, la prueba saldrá positiva cuando viré de rojo a amarillo y será por la dermentación de los carbohidratos realizada por los microorganismos. Pero el medio utilizado fue rojo de metilo y, Britanialab describe como resultados positivos a la prueba del rojo de metilo, de color rojo y negativo de amarillo, siendo útili este medio para la clasificación de enterobacterias, y los mircoorganismos usados, a excepción de S. aéreos, eran enterobacterias, por lo que el revelado no fue exitoso o no se empleó realmente el rojo de metilo. Prueba en agar triple azúcar y hierro (TSI) Por el cambio de color observado en la Tabla 4 , McFaddin en 2001 describe que son resultados positivos para esta prueba debido a la fermentación de los tres azucares: glucosa, sacarosa y lactosa, debido al color amarillo presentado. También, en esta prueba hay producción de H2S que se manifiesta por la aparición de un precipitado color negro, la cual no hubo, por ende, no hubo reducción de la sal de hierro presente en el medio. Desaminación y descarboxilación de aminoácidos en medio LIA Laboratorios Britania, para Proteus mirabilis de acuerdo a la coloración resultante hubo una desaminación de lisina y una descarboxilación de la lisina para la Salmonella y Enterobacter, pero solo la Salmonella dio positiva la prueba de producción de ácido sulfhídrico debido al ennegrecimiento del medio, todo esto se puede observar en la Tabla 5. En esta prueba fue posible diferenciar las enterobacterias. Prueba de citrato de Simmons Este medio es utilizado para la diferenciación de enterobacterias, en base a la capacidad de usas citrato como única fuente de carbono y energía, como describe Laboratorio Britania, los resultados positivos son cuando hubo crecimiento y el medio es de color azul en el pico, presentando alcalinidad, entonces la Salmonella, el inoculo tomado de la caja Petri contaminada con E. coli y la muestra problema, se consideran positivas dado este criterio. La E. coli y la muestra del cultivo del cosmético, permaneció de color verde debido a que no hay desarrollo bacteriano y no hay cambio de color; tal y como dice esta fuente la E. coli da resultado negativo.

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Prueba de urea Esta prueba se fundamenta en determinar la capacidad del microorganismo de hidrolizar la urea en dos moléculas de amoniaco por medio de la enzima ureasa, con la resultante alcalinidad, además que diferencia los microorganismos de la familia Proteus que son rápidamente positivos de otros miembros de la familia Enterobacteriaceae por su capacidad de producción de la enzima ureasa. (McFaddin,2003). Con base a esto podemos atribuir el color rosa presentado en la Tabla 8 a la diferenciación de la familia Proteos mirabilis a las Enterobacteriaceae de las muestras problema y la contaminada, ya que como se dijo anteriormente, éstas resultaron positivas en la identificación de esta familia en anteriores pruebas. Para S. aureus, al no pertenecer a Proteus, es evidente que dio negativa. Prueba de la producción de catalasa Dicho por (Koneman, Allen, & Janda, 2008), la prueba de la catalasa se usa muy a menudo para diferenciar los estafilococos (positiva) de los estreptococos (negativa) o las de Clostridium tertium (negativa) de las especies de Bacillus (positiva), lo que se puede observar en la Tabla 9, siendo esta prueba exitosa pues se apega a la teoría.

Conclusiones Con base a los objetivos planteados en la presenta práctica, se concluye que se realizaron las pruebas pertinentes para identificar bacterias de interés farmacéutico, a través de su metabolismo microbiano, de acuerdo a pruebas que determinaron su actividad enzimática, las cuales eran sobre carbohidratos y sales orgánicas como principales fuentes de carbono, hidrólisis para aminoácidos y proteínas y procesos de óxido-reducción. Cabe mencionar que la muestra problema, con base a las pruebas realizadas, se identifica de la familia Enterobacteriaceae al igual que la muestra contaminada, y la de cosméticos no se contó con las suficientes pruebas para clasificarla.

Referencias Merino, L. (s.f.) Familia enterobacteriaceae. Universidad Nacional del Noreste. Recuperado el 01 de junio de 2017. Sitio web: http://ecaths1.s3.amazonaws.com/catmicromed/APUNTE%20Enterobacterias.pdf Mayaguez, R. u. (2001). El microscopio y las células. Recuperado el 01 de junio de 2017, de http://academic.uprm.edu/~jvelezg/labmicroscopio.pdf Madigan M. & Martinko J.,(2005), Brock Biology of Microorganisms, 11ª Ed., Prentice Hall. McFaddin, J.F., (2003). Pruebas bioquímicas para la identificación de bacterias de importancia clínica. 3ª edición. Buenos Aires: Editorial Medica Panamericana. Laboratorios Britania S. A. (Online). MR-VP Medio. Recuperado 02 de junio de 2017. Sitio web: http://britanialab.com.ar/esp/productos/b02/mr-vpmedio.htm Laboratorios Britania S. A. (Online). Lisina Hierro Agar. Recuperado 02 de junio de 2017. Sitio web: http://www.britanialab.com.ar/esp/productos/b02/lisinahierroagar.htm Laboratorios Britania S. A. (Online). Simmons Citrato Agar. Recuperado 02 de junio de 2017. Sitio web: http://www.britanialab.com.ar/esp/productos/b02/simmonscitagar.htm Koneman, E. W., Allen, S., & Janda, E. (2008). Diagnóstico Microbiológico. Texto y Atlas Color. En E. W. Koneman, S. Allen, & E. Janda, Diagnóstico Microbiológico. Texto y Atlas Color (págs. 38-39). Buenos Aires: Editorial Médica Panamericana.

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