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Apuntes Tema 2 de Tecnologia del DNA Recombinante....

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TDR-2, PRIMERA PARTE Vector de clonación Se define como vector de clonación una molécula de DNA que transporta el material genético clonado dentro de una célula huésped y que es responsable de la amplificación del DNA clonado (se replica dentro de la célula bacteriana produciendo múltiples copias). Plásmidos: Son moléculas de dsDNA extracromosómico y de forma circular. Bacteriófagos: Son virus que sirven de portadores de material genético a bacterias. Cósmidos: Son vectores sintéticos que combinan características de Fago Lambda que posee extremos cohesivos o regiones Cos. Eschericchia Coli: Bacteria más transformada

- Bacteria gram-negativa: Membrana de peptidoglicano rodeada por una membrana externa. - Presente en microbiota humana (boca e intestino), también en tierra y agua. - Muy usadas para propagar fragmentos de DNA clonado, mantiene intactas las construcciones -

de DNA. Fáciles de crecer, usan un medio de cultivo barato. Crecimiento rápido: Se duplican cada 20 minutos. Genoma estudiado y mapeado. Las cepas usadas en el laboratorio son seguras y están mutadas para que no se puedan propagar fuera de el. Acepta copias extracormosómicas de DNA (plásmidos y bacteriófagos) usados para llevar DNA foráneo.

Tipos de vectores de clonación naturales Plásmidos bacterianos:

-

DNA de doble cadena covalentemente cerrado (cccDNA). Replicación autónoma del cromosoma bacteriano (Ori). Algunos se integran al cromosoma bacteriano (episomas) . Múltiples copias del plásmido dentro de cada célula (hasta 200 plásmidos por célula). Se necesita la acción humana para introducir el plásmido en la bacteria (transformar la bacteria)

Bacteriófagos:

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Genoma/cromosoma de virus bacterianos. cccDNA o DNA lineal. El virus inyecta en DNA vírico en la bacteria. Replicación independiente del cromosoma bacteriano. Algunos se insertan en el cromosoma bacteriano. Cada bacteria infectada acaba produciendo varias copias del virus.

Características esenciales de los vectores de clonación

- Contienen su propio origen de replicación (Ori): replicación autónoma, independiente al cromosoma bacteriano.

- Contiene elemento para la selección de bacterias transformadas. - Dianas de restricción únicas Además, para que los vectores sean eficaces deben tener:

- Un bajo peso molecular: Lo que le permite insertar un fragmento de DNA más grande. - Que confieran características fenotípicas fáciles de seleccionar en la célula huésped (generalmente genes de resistencia a antibióticos)

- Lugares únicos para varias endonucleasas de restricción: Polilynkers, Multiple Cloning Sites (MCS)

Plásmidos

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Ampliamente distribuidos entre procariotas. Elementos genéticos independientes al cromosoma bacteriano. Plásmidos conjugativos y no conjugativos. Una sola copia o varias copias del mismo plásmido por bacteria. Replicación autónoma. Algunos plásmidos pueden integrarse en el cromosoma bacteriano: Episomas. Tamaño variable 1-250 kb.

Una mima bacteria pueden contener distintos tipos de plásmidos:

Plásmidos bacterianos Son plásmidos bacterianos de cccDNA con origen de replicación (ORI), algunos se integran en el cromosoma bacteriano y se replican hasta 200 plásmidos por célula. Contienen genes que las bacterias necesitan expresar en grandes cantidades en determinadas circunstancias para poder ser seleccionadas:

- Producción de antibióticos. - Producción de Hemolisina: Proteína de bajo peso molecular que produce la lisis de eritrocitos, leucocitos y plaquetas.

- Degradación de compuestos aromáticos: Permiten la degradación de moléculas inusuales como el Tolueno o el Ácido Salicílico.

- Resistencia a antibióticos. - Producción de Enterotoxinas: Proteínas de cadena simple no ramificadas producto del -

metabolismo de ciertas cepas de células o bacilos (bacterias) y que poseen un cierto grado de toxicidad para el organismo humano (son causantes de intoxicaciones alimenticias). Producción de Sulfuro de Hidrógeno. Producción de bacteriocina: Toxina proteica sintetizada por bacterias con el fin de inhibir el crecimiento de bacterias similares o cepas cercanas (poblaciones clonales a partir de una sola especie de célula). Resistencia a metales pesados.

Consisten en marcadores genéticos que confieren un fenotipo el cual puede ser seleccionado a favor o en contra. De todos estos genes los más útiles en ingeniería genética son los que le confieren a la bacteria resistencia a los antibióticos ya que permiten la selección/aislamiento/purificación de las células bacterianas que contienen el plásmido dentro de una mezcla de bacterias.

Replicación de los Plásmidos bacterianos Replicación autónoma (contienen un origen de replicación ORI):

- Replicativos: Los plásmidos más pequeños utilizan la maquinaria de replicación del cromosoma bacteriano de la célula huésped para duplicarse.

- Replicación independiente: Los plásmido más grandes contienen genes que codifican para los elementos necesarios para la replicación del plásmido. Episomas: Es un plásmido que puede integrarse por si mismo en el DNA cromosomal de la célula huésped, de esta manera puede mantenerse en contacto por un largo tiempo, ser duplicado en cada división celular del huésped y volverse parte básica de su mapa genético. Tamaño de los Plásmidos bacterianos Interesa que el plásmido sea pequeño (< 10 kb), de manera que sea más fácil introducirlo en la célula huésped y permita la inserción de un fragmento de DNA más grande.

- Plásmidos astringentes: Son los plásmidos más grandes, más compactados, 1 o 2 copias por célula, son conjugativos.

- Plásmidos relajados: Son plásmidos más pequeños, desde 50 hasta 200 copias (p. ej. pUC18), son los más útiles para la clonación porque al ser más pequeños permite la inserción de fragmentos de DNA más grandes, son NO conjugativos. Conjugación

- Plásmidos conjugativos: Portan genes de transferencia (transfer, tra) que promueven la

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conjugación sexual entre células bacterianas. Es el proceso de transferencia de material genético entre célula procariota (bacteria o arquea) donadora y una receptora mediante el contacto directo o una conexión que las una. Plásmidos NO conjugativos: Carecen de genes tra, pero pueden ser cotransferidos con plásmidos conjugativos si ambos están en la misma célula.

La conjugación es un mecanismo de transferencia horizontal de genes, como la transformación y la transducción, con la diferencia de que estos últimos no involucran el contacto intercelular. La transferencia de un elemento génico móvil o conjugativo (transposón o plásmido) es unidireccional, no hay intercambio de material génico. La mayoría de plásmidos conjugativos tienen sistemas que aseguran que la célula receptora no tenga ya un mecanismo similar. La información genética transferida a menudo beneficia al receptor (resistencia antibiótica, tolerancia xenobiótica o capacidad de usar nuevos metabolitos).

La conjugación bacteriana es una habilidad concedida por los genes tra (transferencia, fertilidad) que pueden estar presentes en el plásmido circular y replicarse de forma independiente al cromosoma bacteriano (plásmido conjugativo) o pueden estar integrados en el cromosoma bacteriano. Las bacterias que contienen ese gen usan una pili para transferir el material genético a la bacteria receptora. *Transferencia horizontal: Es el movimiento de material genético entre organismos unicelulares o pluricelulares, que no es a través de la transmisión vertical (la transmisión del DNA de padres a la descendencia). Existen de 3 tipos: - *Conjugación procariota - *Transformación: Es la alteración genética de una célula resultantes de la absorción directa, incorporación y expresión del material genético exógeno. El DNA exógeno se encuentra en el ambiente y se introduce a través de las membranas de la célula bacteriana. La transformación puede ocurrir de forma natural aunque también se puede efectuar por medios artificiales. A la transformación de células eucariotas se le llama transfección. - *Transducción: Es el proceso mediante el cual el DNA es transferido desde una bacteria a otra mediante la acción de un virus. También es el proceso mediante el cual DNA exógeno es introducido en una célula mediante un vector viral. Clasificación de los plásmidos naturales En función de las características/funciones codificadas por los genes en el plásmido:

- Plásmido F (fertilidad): Portadores solamente de genes tra (promueven la conjugación bacteriana) y no aportan ninguna otra función, p. ej. plásmido F de E. coli.

- Plásmidos R (resistencia): Portan genes que confieren resistencia a antibióticos, bactericidas o

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bacteriostáticos, como cloranfenicol, ampicilina, tetraciclina, kanamicina, mercurio. En cepas patógenos a humanos, tienden a expandirse entre poblaciones naturales que se convertirán en resistentes a antibióticos. Plásmidos Col: Codifican para colicinas, proteínas que matan a otras bacterias, p. ej. ColE1 de E. coli. Plásmidos degradativos: Codifican para enzimas que permiten la metabolización de compuestos inusuales como el Tolueno o el Ácido Salicílico, p. ej. TOL de Pseudomonas putida. Plásmidos de virulencia: Confieren patogenicidad a la bacteria portadora, p. ej. plásmidos Ti de Agrobacterium tumefaciens, que induce crown gall disease en plantas dicotiledoneas.

*Bactericida: Son sustancias que provocan la muerte de las bacterias p. ej. antibiótico o lisozima.

*Antibiótico: Es una sustancia química producida por un ser vivo o artificialmente, que mata o impide el crecimiento de ciertas clases de microorganismos. Es una sustancia bactericida. *Bacteriostático: Es una sustancia que no produce la muerte de la bacteria pero impide su reproducción, la bacteria envejece y muere sin descendencia. Plásmidos en Eucariotas Solo se han descrito en levaduras (hongos unicelulares) p. ej. plásmido de Saccharomyces cerevisiae (plásmido de 2 micras). La búsqueda de plásmidos (elementos extracromosómicos de replicación autónoma) en hongos filamentosos, plantas y animales no ha dado resultado. Plásmidos sintéticos En los primeros experimentos de clonación, los vectores de clonación utilizados eran plásmidos naturales, como Col E1 y pSC101. Aunque estos plásmidos son pequeños y tienen sitios individuales para las endonucleasas de restricción comunes, tienen un número limitado de marcadores genéticos para la selección de transformantes. El más utilizado en ingeniería genética es el pBR322, el cual esta totalmente secuenciado y tiene su mapa de restricción bien caracterizado. Con un tamaño de 4361 pb tiene 40 lugares únicos de restricción, 11 de ellos en el gen Tcr y 6 de ellos en el gen Apr, es decir, en los genes de resistencia a la tetraciclina y ampicilina.

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Por otra parte también es muy utilizado el plásmido sintético pUC que es un derivado de pBR322, este contiene la mayoría de las dianas de restricción en la zona polylinker, el cual se encuentra en un gen que nos permite la selección, el LacZ. La zona “rep” es donde se encuentra el origen de replicación.

Fagos bacterianos Los bacteriófagos como todos los virus solamente contienen ácido nucleico (DNA o RNA) que codifica para genes necesarios para la replicación del material genético del virus y para la cápside proteica. Según su estructura se pueden clasificar en “cabeza y cola” (Fago Lambda) y en virus “filamentoso” (M13). *Virión: En microbiología se denomina virión a la partícula vírica morfológicamente completa e infecciosa. Está compuesta por:

- Ácido nucleico vírico: Pude ser DNA o RNA, solo uno de ellos, y de cadena doble o sencilla. Lo mas frecuente es DNA bicatenario lineal o circular, o bien RNA bicatenario siempre lineal.

- Proteínas víricas: Forman la cubierta externa o cápside. Compuesta por subunidades

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denominadas capsómeros. Cada capsómero puede estar formado por una o más subunidades proteicas que son constantes para cada virus. Los capsómeros son proteínas estructurales, pero el virión puede tener también proteínas enzimáticas y aglutinantes. Las subunidades proteicas codificadas por los virus se autoensamblan para formar una cápside, generalmente necesitando la presencia del genoma viral. Sin embargo, los virus complejos codifican proteínas que contribuyen a la construcción de su cápside. Nucleocápside: Una cápside interior mas el genoma (DNA o RNA), asociación de proteínas de la cápside vírica con ácidos nucleicos víricos. En algunos casos el virión (virus con envoltura) contiene también una membrana lipídica que envuelve la nucleocápside y contiene proteínas de origen viral y algunas proteínas de la célula infectada.

Patrón general de infección de un bacteriófago 1. Unión a la bacteria e inyección del DNA. 2. Replicación del DNA vírico (normalmente con enzimas codificadas por el propio fago). 3. Síntesis de las proteínas que forman la cápside, encapsulación del DNA y liberación de viriones (nuevas partículas de fago).

Fagos con ciclo lítico El ciclo lítico es el principal método de reproducción e involucra la destrucción de las células infectadas. El ciclo consta de las siguientes fases: 1. 2. 3.

4. 5.

Fase de adsorción o fijación: El virus se une a la célula huésped de forma estable. La unión es específica, ya que el virus reconoce complejos moleculares de tipo proteico, lipoproteico o glucoproteico, presentes en las membranas celulares. Fase de penetración o inyección: El ácido nucleico viral entra en la célula mediante la perforación que el virus realiza en la pared bacteriana. Fase de eclipse: En esta fase no se observan copias de virus en la célula, pero se está produciendo la transcripción de RNA, necesario para generar las copias de proteínas de la cápsida. También se produce la continua formación de ácidos nucleicos virales y enzimas destructoras de DNA bacteriano. Fase de ensamblaje: En esta fase se produce la unión de los capsómeros para formar la cápsida y el empaquetamiento de ácido nucleico viral dentro de ella Fase de lisis o rotura: Conlleva la muerte celular. Los viriones salen de la célula mediante la lisis enzimática de la pared bacteriana. Estos nuevos virus se encuentran en situación de infectar una nueva célula.

Un ejemplo de fago con ciclo lítico es el Fago Lambda (Fago λ) que tiene ciclo lítico y ciclo lisogénico.

Fagos con ciclo Lisogénico En la fase de eclipse, el ácido nucleico viral (DNA bicatenario), se integra en el DNA bacteriano y permanece inactivo. Esta forma viral se denomina profago y la célula infectada se denomina célula isogénica.

Esta célula puede permanecer así indefinidamente y puede llegar a dividirse, durante este periodo la célula bacteriana no muere. Un cambio en el medio celular, va a llevar consigo un cambio celular y con él, la liberación del profago, convirtiéndose en un virus activo que continuará con el ciclo infeccioso o ciclo lítico, es decir se continuará con la fase de ensamblaje y la fase de de liberación o lisis (en la que se libera el virus produciendo la lisis celular). Un ejemplo de virus con ciclo lisogénico es el del tipo Lambda, que integra el DNA del fago en el cromosoma bacteriano (como los episomas) en forma de profago, se mantiene durante cientos de divisiones mitóticas dentro del cromosoma. En un momento dado (desencadenado por diversos factores) el profago se separa del cromosoma y comienza la fase lítica.

Fago tipo M13 Continuamente se replica el DNA, se ensamblan los componentes víricos y se secretan virus. No hay integración en el genoma bacteriano ni lisis celular, solamente la célula crece mas despacio.

Fago Lambda Estructura del Fago Lambda Estructura de cabeza-y-cola. Ciclo lítico y ciclo lisogénico. 48.5 kb doble cadena de DNA lineal. Genes agrupados en Clusters, es una agrupación física y funcional. Clusters de funcionalidad ligados a genes del DNA del Fago Lambda:

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Componentes de la cápside. Integración y excisión. Expresión temprana. Síntesis DNA. Expresión tardía (COS). Lisis del huésped. Una región no esencial (b2) se puede sustituir por el DNA que queremos clonar, manteniendo intacto el tamaño de 49 kb del genoma de Lambda.

Replicación de Rolling Circle del Fago Lambda El primer paso es la rotura de una de las hebras de las dos cadenas del plásmido (muesca) por parte de una proteína iniciadora codificada por el DNA del plásmido o del bacteriófago en un sitio llamado origen de la doble cadena (DSO, double-strand origin). La proteína iniciadora permanece unida al extremo 5 'fosfato de la cadena cortada, y el extremo 3' hidroxilo libre sirve como cebador para la síntesis de DNA por la DNA polimerasa III. Usando la hebra no cortada como plantilla, la replicación se desarrolla alrededor de la molécula de DNA circular, desplazando la hebra cortada como DNA de una sola hebra. El desplazamiento de la cadena cortada se realiza mediante una helicasa codificada por el huésped llamada PcrA en presencia de la proteína de iniciación de la replicación del plásmido. La síntesis continua de DNA puede producir múltiples copias lineales de una sola hebra del DNA llamadas concatámeros. Estas copias lineales pueden servir como molde para sintetizar la cadena de DNA complementario (utilizando primers de RNA) formando concatámeros de doble cadena con la región COS que es la diana del gen A endonucleasa que cortará en secciones el DNA lineal y darán como resultado los fragmentos de DNA del fago lambda que se empaquetaran e infectaran nuevas bacterias.

Bacteriófagos: Vectores derivados del Fago Lambda El Fago Lambda no es el más apropiado para utilizarlo como vector porque tiene muchas dianas de restricción y poca capacidad para acomodar el inserto. Los objetivos de los vectores derivados del Fago Lambda son:

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Aumentar la capacidad para acomodar el inserto. Incorporar dianas de restricción únicas. Facilitar la selección. Otras mejoras para facilitar el trabajo con librerías genómicas.

Bacteriófagos: Vectores de cadena sencilla

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Fagos filamentosos: M13, f1, fd. Contienen una cadena de DNA sencilla, circular y envuelta por una cápside de proteínas. M13 tiene solo 6407 nucleótidos. Cápside compuesta principalmente por una proteína (g8p) y 4 más en menor cantidad. Fago solo con ciclo lisogénico. Replicación por rolling circle. Pueden infectar E. coli a través de pili.

Replicación por rolling circle de bacteriófagos de cadena sencilla (fagos filamentosos) El fago filamentoso inyecta su material genético en la célula huésped (cadena sencilla circular de DNA) a través de la pili de la bacteria, posteriormente se sintetiza la segunda cadena del DNA circular de manera que pasa a ser un DNA de doble cadena circular (RF, forma replicativa). Se produce la replicación del RF DNA para producir varias moléculas de doble cadena circular. Por último las FRs producidas se replican mediante la replicación del círculo rodante para producir concatámeros de cadena sencilla de DNA que seran recirculizados y encapsulados para dar

lugara a partículas víricas maduras (M13, fagos filamentosos). Como sabemos el Fago M13 no tiene ciclo lítico ni se integra en el cromosoma bacteriano (como en el ciclo lisogénico) sino que los Fagos M13 maduros se van produciendo continuamente y saliendo de la célula sin destruirla.

Mejora de M13

- M13mp1: Contiene una región Lac util para su selección, pero solo contienen dianas de restricción únicas para 3 enzimas: AvaII, BgII, PvuI.

- M13mp2: Además tiene una diana de restricción para EcoRI. - M13 mp7-11, mp18-19: Contiene polylinkers. Ventajas de los fagos filamentosos

- El DNA se replica en forma de cadena doble (RF) de manera que puede ser manipulado como un plásmido.

- Tanto la cadena doble como la cadena sencilla (fagos filamentosos) sirven para transformar la bacteria.

- La...