Técnicas Histológicas PDF

Preview

Summary

En el presente documento se describen las técnicas histológicas...

Description

TÉCNICAS HISTOLÓGICAS 1. RESUMEN En los laboratorios de Histología, es imprescindible el uso de varias técnicas para posibilitar la observación de tejidos, que no pueden ser vistos por su grosor por medio del microscopio. Dentro de la práctica de Histología se procedió con la observación de un video sobre “Técnicas Histológicas: Un abordaje práctico”, con la finalidad de saber cuáles son los procedimientos que se deben seguir para una correcta preparación de la muestra. 2. INTRODUCCIÓN El objeto de estudio de la histología son los tejidos (y las células que los componen). A fin de estudiarlos y comprenderlos, cuenta con dos poderosas herramientas que le permiten observar la microestructura celular y tisular: la microscopía y la técnica histológica. La técnica histológica es la serie de pasos ordenados que permiten preparar al tejido para su observación a través del microscopio. El tejido se prepara para su observación de acuerdo con el tipo de microscopio que será utilizado. En el caso de la microscopía de campo claro, la técnica más común para preparar las muestras es la técnica histológica ordinaria o de inclusión en parafina. En este proceso, las muestras se infiltran en parafina, con el fin de que tengan la consistencia adecuada para obtener los bloques con las muestras o especímenes. Una vez que se tienen los bloques (inclusión), éstos se cortan en un equipo que se llama micrótomo y con el que se obtienen cortes muy delgados (micrómetros de espesor) lo que permite observar las estructuras celulares y tisulares. Un paso más allá que ofrece la información más detallada corresponde al momento de aplicar la tinción, que da colores a la muestra y gracias a ello es posible identificar diversas estructuras mediante la observación de estas preparaciones con el microscopio de campo claro.

3. OBJETIVOS 3.1 OBJETIVO GENERAL  Investigar todo sobre la Técnica Histológica mediante revisiones bibliográficas y material audiovisual para conocer y aplicar estos conocimientos dentro de la cátedra de Histología. 3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS  Conocer los distintos pasos para realizar correctamente la preparación de la muestra para su posterior observación.  Indicar los materiales que son necesarios en la Técnica Histológica para realizar la preparación de la muestra. 4. MARCO TEÓRICO Se denomina Técnicas Histológicas al conjunto de procedimientos aplicados a un material biológico (animal o vegetal) con la finalidad de prepararlo y conferirle las condiciones óptimas para poder observar, examinar y analizar sus componentes morfológicos a través de los microscopios ópticos y electrónicos. Etapas de la técnica histológica 1. Recogida del material

6. Inclusión

2. Fijación

7. Microtomía o sección

3. Tallado

8. Tinción

4. Descalcificación

9. Sellado

5. Procesamiento

10. Observación microscópica

1 Recogida del material: La muestra a utilizarse pueden ser extraído de los diversos animales de laboratorio, o bien puede ser de un ser humano.

Fases de la obtención de material animal:  Muerte del animal  Extracción de los órganos  Reducción a piezas Obtención del material humano: Se efectúa mediante biopsia, piezas operadas, necropsia o autopsia. 

Biopsia: Son trozos de tejido que se obtienen de un sujeto con vida con el objeto de estudiarlos al microscopio y efectuar un diagnóstico histopatológico.



Necropsia o autopsia: Es el procedimiento en el cual se extrae material de un cadáver. La autopsia consiste en el estudio analítico y sistemático completo, macroscópico y microscópico de los órganos, aparatos y sistemas de un cadáver. Se realiza para establecer causas de muerte. o Es recomendable que en los siguientes casos se efectué la necropsia médico legal:

1.- En todas las muertes violentas incluyendo aquellas en que este la duda de violencia. 2.- Personas que fallecieron en áreas de reclusión y/o seguridad y que estuvieron bajo responsabilidad de servidores públicos de seguridad pública y procuración de justicia. 3.- Muertes en la vía pública. 5.- Muertes sospechosas de haberse producido por violación a los derechos humanos. 

Piezas operadas: Los tejidos que han sido extraídos de las intervenciones quirúrgicas, generalmente tumores u órganos inflamados, pero, sólo servirán para anatomía patológica.

2 Fijación: Una vez obtenido el material que se desea estudiar por cualquiera de los

procedimientos descriptos se procede a su fijación con lo que se evita la destrucción o autolisis celular. Es un proceso físico-químico complejo por el cual se mantiene a las estructuras orgánicas en el estado más parecido al que poseían en vida. Los objetos de la fijación son: 

Evitar la autolisis y la proliferación bacteriana.



Detener el metabolismo celular, manteniendo el contenido bioquímico y preservando antígenos.



Preservar tejidos para futuras tinciones.



Mantener las estructuras en el estado más parecido al que poseían in vivo.



Mejorar la diferenciación óptica de las células preservando identidad.



Dar cierta solidez o dureza al tejido o material. La fijación detiene los procesos vitales pero en ciertas condiciones mantiene las actividades de algunos componentes moleculares, por ejemplo la actividad de algunas enzimas

Tipos de fijadores -Físicos: Por ebullición. Por congelación: bajas temperaturas de –190ºC a 70ºC (Nitrógeno líquido. dióxido de carbono) permiten excelentes fijaciones. a) Desecación.

d) Frío.

b) Calor seco.

e) Congelación y desecación.

c) Calor húmedo. -Químicos: Son los más utilizados; pueden ser: Fijadores simples, constituidos por una sola sustancia química. a) Formol al 10%, es el más usado. Su empleo es aconsejable en todos los casos en que no se disponga de un fijador especial, principalmente cuando se trata de fijar órganos o tejidos para estudios histológicos topográficos.

b) Alcohol etílico absoluto o de 96%, se usa generalmente en microquímica. c) Alcohol metílico, se lo emplea con frecuencia para fijar frotis desecados (sangre, médula ósea, ganglio, bazo, líquidos de punción, etc.). Fijadores compuestos o mezclas fijadoras, cuando varias sustancias intervienen en su constitución. En su composición intervienen un número variable de fijadores simples racionalmente elegidos con el fin de completar la acción de cada uno de ellos o atenuar sus defectos. a) Líquido de Fleming, mezcla cromo-osmio-acética. b) Líquido de Zenker, mezcla bicromato-sublimado-acética. c) Líquido de Helly, mezcla Zenker-formol. d) Líquido de Bouin, mezcla picro-formos-acética. e) Liquido de Duboscq-Brasil, o Bouin alcohólico. Factores que influyen en la fijación: 

Temperatura



Volumen de la solución fijador (el volumen del fijador debe ser 20 veces mayor al tamaño del tejido)



Concentración



pH de la mezcla fijadora



Osmolaridad



Grosor de la muestra (mientras más pequeñas mejor)

Reglas para la fijación



Relación del volumen del tejido a fijarse con el volumen del fijador: es necesario que los trozos a fijar sean de un espesor no mayor de 0.5 mm. Para una buena fijación es necesario que la relación volumen del tejido volumen del fijador sea de 1/40. Tamaño de la Muestra: El tamaño de la muestra debe de ser de 2-3 cm. variando el estudio para lo cual se va a utilizar.



Tiempos de fijación: depende del tejido, su volumen y el fijador usado Cuando se usa el formol las piezas pequeñas requieren algunas horas y ya a las 24 horas se fijan bien. La fijación se puede controlar a simple vista por el cambio de color del tejido y su consistencia (se endurece) pero una buena fijación solo se aprecia en el corte ya preparado observando al microscopio óptico. Regla de Oro para la Fijación: La mejor fijación es cuando ha pasado el menor tiempo entre la muerte del tejido y la fijación.



Lavado: después de la fijación el tejido debe ser convenientemente lavado con agua o bien con otras sustancias que eliminan restos de fijadores especiales.

3- Tallado: Se denomina tallado al proceso de reducción del tamaño y grosor de los fragmentos fijados, permitiendo más eficazmente la penetración del fijador hacia el interior de la muestra y en consecuencia la mejor difusión de los reactivos durante el procesamiento histológico. Se recomienda que la muestra tenga un tamaño mínimo de 3mm. 4- Descalcificación: Se la realiza en aquellas muestras que no pueden ser vistos fácilmente en el microscopio debido a su consistencia pétrea, como los huesos. Tipos de descalcificadores: 

Ácidos (Acidos débiles y Ácidos fuertes)



Histoquímicos



Soluciones descalcificadoras comerciales



Resinas de intercambio electrolítico



Descalcificadores electrolíticos

Factores en la elección del método de descalcificación: 

La urgencia del material



El grado de mineralización del tejido



La tinción que va ser empleado



El tipo de fijador utilizado

5- Procesamiento: El procesamiento reúne procedimientos que permiten sustituir el agua que se encuentra en los tejidos por un medio más sólido, que confiera la resistencia y dureza necesarias para ser cortado. Las etapas del procesamiento de tejidos son: Deshidratación, Clarificación e Imbibición. Deshidratación: Consiste en retirar el agua de los fluidos tisulares y fluidos acuosos, mediante la difusión de agentes deshidratantes. Se coloca la muestra en alcoholes de concentración creciente para eliminar el agua que contenga ya que la parafina no es miscible con agua. Se utiliza etanol 70%, 80%, 96% y 100%. Clarificación: Proceso que permite la retirada de alcohol utilizado durante la deshidratación de los tejidos mediante un agente clarificador. Los clarificadores, son solventes que producen transparencia en los tejidos, además de solubilizar la parafina. Entre ellos se encuentran el xilol, toluol, acetona y benceno. El más usado es el Xilol. Imbibición: Es la saturación de las cavidades de los tejidos y las células por una sustancia, que es generalmente el medio en que estas sean incluidas como la parafina. -Principales factores que influyen en el procesamiento  El tamaño de la muestra  Tipo de reactivos utilizados  Especie animal (insecto, moluscos)  Propiedades de los tejidos

 Presencia de vacío  Temperatura durante el procesamiento 6 Inclusión: Es el proceso donde el tejido es colocado en un molde cubierto con parafina fundida, tras ser totalmente impregnado por la misma. La parafina es una mezcla de hidrocarburos saturados que tienen diferentes puntos de fusión. Parafina blanda funde a 44 – 48ºC y la parafina dura a 56 – 58ºC. La parafina se pone en estufa de cultivo a unos grados por encima de su punto de fusión. Se sumerge la muestra, se lleva a estufa unos minutos para que la parafina penetre en los tejidos. Luego se enfría bruscamente colocando el recipiente en hielo. La inclusión se la puede realizar en una: Estufa o en Estaciones de inclusión. Estaciones de Inclusión: Son aparatos que facilitan la imbibición en parafina, garantizando una distribución perfecta de la temperatura. Están compuestas de: 

Un contenedor que contiene a los casetes que contienen a los tejidos



Un recipiente para los moldes



Un dispensador de parafina



Una placa calefactora en donde se realiza la inclusión



Una placa refrigerada

Recomendaciones durante la inclusión: 

La temperatura de la parafina no debe exceder 5°C por encima de su punto de fusión.



Las pinzas utilizadas en la inclusión deben estar calientes o de lo contrario dañan al tejido



Se deben incluir solamente los tejidos muy bien procesados ya que pueden dificultar procesos siguientes

7 Microtomía: La microtomía es el proceso durante la cual se cortan los bloques de parafina

en finas capas, permitiendo la observación de las células . Se realiza mediante el uso del micrótomo. El micrótomo de congelación permite cortar el tejido después de fijarlo por frío, congela con dióxido de carbono y lo endurece para que luego pueda ser cortado. Es un método rápido y por eso se usa para el diagnóstico de biopsias obtenidas en el acto quirúrgico para que el cirujano proceda según este informe. Se lo usa también para visualización de lípidos y es muy útil en el estudio de tejido nervioso Los micrótomos para corte incluidos en parafina son: el de deslizamiento, en el que la cuchilla es móvil y el tejido que se corta está fijos y el tipo Minot, en el que el tejido se moviliza y la cuchilla está fija. Los cortes pueden tener un espesor de 4 a 4 a 100  m o más, según los tejidos que se deseen estudiar. La microtomía la realiza un profesional muy bien entrenado, teniendo en cuenta: 

El tipo de micrótomo: Se debe utilizar micrótomos especializados, como los criostatos para material congelado y los ultra micrótomos para microscopía electrónica.



Cuchillas: Es necesario el uso de cuchillas extremadamente afiladas. Existen dos tipos de cuchillas: acero y desechables.



El procedimiento de lavado e identificación de los portas: Los portas deben ser identificados antes de realizar la microtomía. Se la puede realizar con etiquetas o con lápiz de diamante (no utilizar el lápiz de grafito).



La utilización de las sustancias adhesivas: Una vez realizado los cortes, estas deben ser adheridos a los portas por medio de sustancias como: Albumina de Mayer, Gelatina, Caseína y Silano.



La ejecución de la microtomía: Se utiliza una cuchilla vieja al inicio del corte y luego remplazarlo por una nueva.



Problemas técnicos más comunes: Se debe a una mala fijación o por pasos

anteriores a estos. Colocación sobre portas: Efectuados los cortes se colocan en agua tibia para que se extiendan y luego se recogen con un pincel y se los extienden en el portaobjetos y se dejan secar para su posterior coloración. 8- Tinción: Es una operación destinada a hacer visibles los tejidos al microscopio con la ayuda de soluciones colorantes. Los fragmentos dispuestos en portas de vidrio al final de la microtomía son transparentes y necesitan ser coloreados para visualizar mejor y caracterizar sus células y componentes tisulares en el contexto morfológico e histoquímico. Es un completo complejo físicoquímico que le confiere color a los tejidos durante tiempos prolongados. Las moléculas de colorantes tienen un grupo que es el que le confiere el color: cromóforo y otro que lo fija auxocromo. Los colorantes son sales pero se los clasifica en: 

básicos: en donde la molécula de sal que colorea es la base como por ejemplo el azul de toluidina, azul de metileno, hematoxilina;



ácidos: donde la molécula de sal que colorea es el ácido como por ejemplo la eosina



neutros: donde las dos partes de la solución salina proporcionan color, es un ejemplo de esta el eosinato de azul de metileno.

Tipos de coloración: 

Comunes: hematoxilina y eosina, azul de metileno.



Específicas método de Regaud. Impregnación argéntica de Cajal o Golgi



Vitales: -lntravitales: La coloración intravital consiste en inyectar una sustancia inocua para

el animal pero que es fagocitada, por ciertas células, como por ejemplo los macrófagos o fagocitos. -Supravitales: La coloración supravital es la que colorea a los tejidos vivos pero separados del organismo. Ejemplo: verde jano para las mitocondrias. 

Metacromáticas: La coloración metacromática es aquella que confiere al tejido un color diferente al del colorante utilizado. Por ejemplo al colorear gránulos de las células cebadas de color rojo.

El colorante más utilizado es la: Hematoxilina Eosina Procedimientos generales en la tinción: Desparafinización: Para iniciar con la tinción de sede retirar la parafina para que los colorantes penetren y se combinen con los tejidos. Se utiliza Xilol. Se recomienda realizar 3 baños de xilol durante 3 min para la remoción completa de parafina. Hidratación: Se debe hidratar el tejido ya que la mayoría de los colorantes son de base acuosa. Para ello se coloca el portaobjeto en soluciones de etanol de concentraciones decrecientes. Etanol 100%, 96%, 80%, 70% y Agua destilada Deshidratación: Para preparar los preparados por tiempo prolongado. Se sumerge el preparado en soluciones de etanol de graduación crecientes (70%, 80%, 96%, 100%). Clarificación: Se utiliza xilol o benzol, y sirve para diluir la resina adhesiva utilizada para pegar el cubre objeto. 9- Sellado: Se cubre el corte con un delgado vidrio (el cubreobjeto) que se adhiere con resina (bálsamo de Canadá) y permite su uso prolongado. 10- Observación microscópica

5. MATERIALES Y MÉTODOS UTILIZADOS  Proyector  Mandil  Método: Observación y clases magistrales por parte del docente. 6. GRÁFICOS Pasos de la técnica histológica

7. CONCLUSIONES

 En conclusión, conocer sobre el procedimiento correcto de las “Técnicas Histológicas” es muy importante, ya que como futuros profesionales de la Medicina tenemos que saber cómo se realizan los distintos pasos para un buen análisis de las distintas muestras.  Hay que tener en cuenta que en cada paso se utilizan distintas sustancias y en concentraciones fijas, para posibilitar una buena fijación.  Una buena fijación es esencial, porque de esta depende los pasos que vienen después y por ende su posterior análisis. 8.

BIBLIOGRAFÍA  Funes J. (2017). Técnicas Histológicas. Universidad Nacional Autónomo de Hidalgo.

Recuperado

el

24

de

Noviembre

del

2018,

de:

https://histo122.files.wordpress.com/2013/02/3-tecnicahisto3.ppt  U.N.S.J (2010). Técnica Histológica. Facultad de Ingeniería. Recuperado el 24 de Noviembre del 2018, de: dea.unsj.edu.ar/biologia1/th.pdf  Universidad Miguel Hernández de Elche (2016). Técnicas Histológicas: Un abordaje práctico. Recuperado el 24 de Noviembre de 2018, de: https://www.youtube.com/watch?v=1eGq3aZDlhU&t=2067s...