Tinciónes Tricrómicas PDF

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Se describe el fundamento, procedimietno y la definicion de una tincion tricromica y su utilidad para el diagnostico parasitario ...

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TINCIÓNES TRICRÓMICAS Las tinciones tricromicas, son tinciones especiales que se utilizan para poder diferenciar entre fibras musculares y fibras de colágeno tipo I, para ello se utilizan tres colorantes; dos citoplasmáticos y uno nuclear. Este método fue inventado por Mallory en 1900 para colorear tejidos conectivos, su fórmula contenía; azul de metileno, Orange G, ácido oxálico, fucsina acida y ácido fosfomolibdico, más tarde en 1912 su método fue modificado por Masson reemplazando el acido fosfomolibdico por acido fosfotungstico, elimina el ácido oxálico y utiliza azul de anilina en vez de azul de metileno.

IMPORTANCIA Y UTILIDAD Esta técnica es de fácil preparación y de larga duración, se utiliza para preparar frotis de heces para la observación de estructuras morfológicas de quistes y trofozoítos al producir contraste muy marcados que facilitan su observación. Este método es la modificación de Wheatley de la tinción tricromica de Gomori que se utiliza para cortes histológicos. Existen varios tipos de tinciones tricromicas entre las cuales tenemos:     

Tinción de Masson Tinción de Mallory Tinción de Gomori Tinción de Van Geison Orceína

La coloración de Gomori y Masson son las más utilizadas por la facilidad de realización y la confiabilidad de sus resultados y la coloración de Van Gieson como la más efectiva para la identificación de fibras de colágeno.

FUNDAMENTO DEL METODO La tinción depende de varios factores: Permeabilidad: Los elementos acidófilos como el colágeno tienen diferentes grados de permeabilidad al paso del colorante que va a depender del grado de dispersión de la disolución, la agregación iónica del colorante en la misma y el tamaño de la molécula. Cada colorante genera un gradiente de penetración diferente al interactuar con la estructura, siendo esta la responsable de las diferentes coloraciones que puedan tomar. Los colorantes utilizados para las tinciones tricromicas se clasifican en:

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Colorantes nucleares: Laca de hematoxilina férrica Colorantes citoplasmáticos: naranja G, ácido pícrico, ponceau de xilidina naranja de metilo, escarlata Biebrich, azofloxina. Colorantes del tejido conectivo: Derivados del anillo trifenilmetano: fucsina ácida, azul de anilina, verde luz SF.

Afinidad: Los aminoácidos que componen la cadena polipeptídica, contienen grupos catiónicos presentes en sus estructuras por ejemplo el colágeno reticulina las cuales van a tener afinidad por colorantes ácidos cargados negativamente.

PH del medio: El medio acido tiñe con mas afinidad las fibras colágenas específicamente en torno a 1.5 de la escala de pH.

Poder de mordiente: El uso de alcohol acidificado como agente decolorante mejora los detalles morfológicos de las estructuras parasitarias, es decir va a permitir diferenciar la unión especifica entre el colorante y la estructura, entre las diferentes sustancias mordientes tenemos los siguientes: fosfotúngstico, molíbdico, crómico, pícrico, sublimado de oro, sulfato de aluminio. Se debe tener en cuenta el fijador utilizado en la muestra para el método de Masson y Gomori se utiliza el fijador de bouin, para el de Mallory, dicromato y el de Van Gieson cualquier fijador.

Para el diagnostico parasitario, los elementos que se encuentran en la materia fecal se tiñen de la siguiente manera: Verde (verde azulado): citoplasma de trofozoítos, citoplasma de leucocitos, quistes, células tisulares, hongos y protozoarios decolorados en exceso. Violeta (azulado o rojizo): Citoplasma de trofozoítos y en ocasiones quistes de E. coli, glóbulos rojos y bacterias ingeridas dentro de los trofozoítos. Rojo: Bacterias dentro de los trofoítos, glóbulos rojos, levaduras, hongos y en ocasiones, núcleos de leucocitos y células tisulares, cromatina nuclear y cuerpos cromatoidales de trofozoítos y quistes. Los quistes de E. coli se tiñen mas oscuros que los de E. histolytica y E. Dispar. Los huevos y larvas se tiñen de color rojo.

PROCEDIMIENTOS Técnica de coloración tricrómica Reactivos necesarios: Fijador: puede ser el de Schaudinn o PVA PREPARACION    

En un frasco limpio añádase 10 ml de acido acético glacial a 6g de cromo tropo 2R, 3g de verde claro SF y 7g de ácido fosfotungstico. Mézclese agitando y déjese reposar la mezcla durante 30 minutos. Añádase 1000ml de agua destilada y mézclese bien: el colorante debe presentar un color violeta oscuro. Guárdese en un rasco con tapón de vidrio, el colorante se mantiene estable y se usa sin diluir.

ALCOHOL ACIDIFICADO   

Acido acético glacial 4,5 ml. Alcohol etílico al 90 % 995ml. Mezclar y conservar en el mismo recipiente.

METODO DE TINCION

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Sumérjase las preparaciones, fijadas con Schaudinn o con PVA, en alcohol al 70 % durante dos minutos. Añádase solución yodada de Lugol diluida a etanol al 70 % hasta obtener un color de té cargado: manténgase los portaobjetos en la solución durante cinco minutos. Lávese dos veces los portaobjetos con alcohol al 70 %. Tíñase las preparaciones con colorante tricromico sin diluir durante 30 minutos. Retire las preparaciones, séquese bien y colóquense en alcohol acidificado al 90 % (Prepárese añadiendo 4,5 ml de acido acético glacial a 1 litro de etanol al 90%), durante 2-3 segundos sumérjase las preparaciones en alcohol al 95 % para enjuagarlas y deshidrátense luego en etanol al 100% y xileno, o en la mezcla carbol-xileno. Móntese con resina o aceite de inmersión y recúbrase la preparación con un cubre objetos....