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Descrizione dei meccanismi di trasposizione e dei vari gruppi di trasposoni...

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Trasposoni

Nei procarioti occupano il 75% del DNA extragenico, il quale codifica per un qualcosa di non specifico, ed è un DNA disperso mediamente ripetuto che noi andiamo a dividere in:  

SINE LINE

I trasposoni sono frammenti del DNA che salta da una parte all’altra, e questi furono scoperti tramite un esperimento avvenuto negli anni 60 da parte di Shapiro, il quale si rese conto che il fago λ durante il ciclo litico dell’infezione a cellule di E.Coli portava con se un frammento genico in più. Lui fece in modo che le particelle dei fagi λ si appropriassero sia di un gene di E.Coli di tipo selvatico necessario per l’utilizzazione del galattosio (gal +) che della sua controparte mutante (gal -). Dopo di ciò misurò attraverso il gradiente a cloruro di cesio, visto che la quantità delle proteine dei fagi era la stessa che a variare era soltanto la quantità di DNA presente, egli vide che nella porzione con (gal –) era più pesante e che quindi vi era una quantità di DNA maggiore, e la quantità maggiore faceva spengere il gene, e successivamente si scoprì che all’incirca 800-1400 bp erano presenti nel gene mutante e vennero poi definite come sequenze d’inserzione (IS). Le IS rappresentano il miglior esempio ed anche il più semplice riguardo i trasposoni batterici, queste contengono solo gli elementi necessari alla loro trasposizione, e queste sequenze IS hanno alle loro estremità delle sequenze più corte, complementari ed invertite, le sequenze IR, e fra queste IR troviamo i geni che codificano per le trasposasi. Le IS sono delle unità autonome e codificano solo per e proteine necessarie alla propria trasposizione, e sono dei costituenti comuni di cromosomi e plasmidi e riconosciamo le IS di vari tipi:     

IS 1 IS 2 IS 3 IS 4 IS 5

Sequenza IS

Ed al loro interno, per cui fra le sequenze IR, avremo le trasposasi i trasposoni inoltre sono considerati come DNA egoista dato che si replicano a spese dell’ospite, come se fossero dei virus, tuttavia alcuni trasposoni portano con sé dei geni che conferiscono resistenza. Invece il trasposone vero e proprio sarà dato da 2 sequenze IS laterali, ed al loro interno vi sono vari geni che spesso danno resistenza agli antibiotici per ciò che riguarda i batteri, qui si verifica l’effetto di trasposizione del trasposone composto verificandone la crescita in un terreno con un antibiotico specifico. Abbiamo inoltre due tipi di trasposizione:  

Replicativa (TN3) Non replicativa (TN10)

I trasposoni grazie alla loro capacità di spostarsi da un gene all’altro vengono chiamati geni che saltano, anche se in realtà questo termine non è corretto poiché questo presuppone che un gene o un trasposone passino da un cromosoma all’altro, ed in questo caso si parla di trasposizione non replicativa, nella maggior parte dei casi la trasposizione invece è di tipo replicativo, perché la porzione di DNA prima si duplica e poi si sposta.

Abbiamo vari tipi di trasposizione come: ˗

Trasposizione per escissione, questa passa per un meccanismo di Taglia e incolla, quasi come nello splicing, con un taglio a doppio filamento nel sito originale ed un taglio sul sito target, ed avverrà una legatura con l’inserzione del trasposone in un nuovo sito, ed infine saranno riparate le rotture avvenute sul sito originale. Qui la trasposasi si lega alle sequenze IR dando luogo ad un complesso nucleoproteico detto sinaptico o trasposoma con 2 o 4 subunità di trasposasi, con le traspsosasi che andranno a scindere il trasposone tagliando le estremità (il DNA fiancheggiante) e l’estremità del trasposone terminerà con il 3’OH, inoltre le estremità 3’OH attaccano la zona del DNA bersaglio dove si formano legami fosfodiesterici tra il gruppo 5’ e l’OH 3’. Il taglio sul secondo filamento avverrà con meccanismi differenti, con Tns Ache si va ad assemblare con la trasposasi TN7, qui la TN10 e la TN5 generano una struttura a forcina all’estremità del trasposone, la trasposasi aprirà la forcina, ed Hermes andrà a tagliare il secondo filamento generando così una struttura a forcina sul DNA donatore e non sul trasposone. I filamenti di DNA ospite vengono tagliati in modo sfalsato e dopo il taglio il trasposone viene legato sul filamento del DNA ospite corrispondente, una volta che le interruzioni sono state riempite, a ciascuna estremità del trasposone compaiono ripetizioni di 9 coppie di basi del DNA ospite

˗

Trasposizione replicativa, questa passa per varie fasi: 1. Vi è il taglio dei due plasmidi al fine di formare le estremità a-h, il taglio avviene ad opera delle trasposasi al fine di andare a liberare le estremità 3’OH, ma senza la scissione del trasposone

2. L’estremità A si unisce con F e la G con D 3. Replicazione del trasposone con due delle estremità libere c e b servono da innesco per la replicazione del DNA 4. La replicazione non termina finché l’estremità b arriva ad e finché c arriva ad h per formare un cointegrato

5. Vi è un crossing over nelle regioni res

Per cui la trasposizione inizierà con il taglio a singolo filamento ai lati del trasposone, poi nel DNA bersaglio il taglio sfalsato a doppio filamento generà brevi sporgenze 5’, le quali saranno poi legate alle estremità 3’libere. ЀЀ molto importante sottolineare che si possono generare riarrangiamenti genomici delle sequenze fiancheggianti per ricombinazione omologa. Questo è testimoniato dal fatto che, una porzione di DNA che normalmente genera una proteina sana, quando questa vede la presenza di una sequenza IS vi può essere la formazione di una proteina assente, o anche tronca, perché la trascrizione verrà bloccata da un elemento trasponibile come è la sequenza IS, ma questa sequenza può anche portare a quella che è un’attivazione di più geni o di una parte di essi, naturalmente geni che normalmente saranno silenti.

Eucarioti I trasposoni all’interno degli eucarioti furono scoperti da Barbara Mc Klinotck dopo uno studio sulle cariossidi del Mais che apparivano di colori diversi, visto che il colore della cariosside era dovuta al gene C che codificava per il pigmento, e se questo è assente avremo il classico colore bianco, mentre se presente sarà viola la cariosside, mentre quando si inserisce per trasposizione la cariosside assumerà un colore pigmentato a mosaico, cosa che avviene grazie al trasposone DS, che quando è presente darà il bianco, invece il trasposone AC, quando presente agirà con il DS dando il colore a mosaico, mentre se è presente solo AC avremo il colore viola. Il trasposone DS può essere di tipo A, B o C, con B e C più piccoli e senza trasposasi, per cui necessitano di AC, dotato delle trasposasi, al fine di effettuare la trasposizione I trasposoni sono stati individuati in tutti gli eucarioti, ad esempio nelle piante come le angiosperme abbiamo una maggior quantità di elementi trasponibili che non, questo perché questi elementi vano ad occupare oltre il 50% del DNA, inoltre bisogna dire che in un genoma di grandi dimensioni i geni si trovano relegati in piccole isole circondate da un mare di retrotrasposoni, nel mais ad esempio costituiscono oltre l’80% del genoma. Le funzioni del DNA altamente ripetitivo (trasposoni) sono solo in parte conosciute e sono state formulate diverse ipotesi  

DNA egoista e parassita (selfish DNA)”: si mantiene nel genoma senza avere alcuna utilità per le cellule. DNA spazzatura (junk DNA)”: porzioni di DNA prive di funzione, rappresentano un “ricordo evolutivo”, prodotto di centinaia di duplicazioni e mutazioni di sequenze un tempo funzionali, costituisce blocchi di DNA che formano il “materiale grezzo” per l’evoluzione di geni funzionali. Funzione strutturale per la cromatina e i cromosomi (centromero, telomeri, origini di replicazione). Funzione di spaziatore fra sequenze importanti, in grado di posizionare regioni cromosomiche distinte in siti diversi del nucleo. Sequenze di DNA “Bodyguard” che fa da scudo per proteggere le sequenze codificanti da agenti esterni (composti chimici, radiazioni).

Più recentemente i trasposoni sono stati considerati organismi simbionti del genoma eucariotico. Il genoma ospite utilizza, in certi casi, i trasposoni per regolare l’espressione genica di geni vicini, sia attraverso la metilazione, sia mediante promotori situati al loro interno. Inoltre attraverso i trasposoni si viene a creare nuova variabilità genetica con la costituzione di nuovi geni e nuovi pattern di espressione genica potenzialmente utili all’ospite.

I trasposoni inoltre sono stati separati in due classi distinte 

Retrotrasposoni, quindi di classe 1 e si dividono in - LTR - NON LTR

l



- Line - Sine (questi per la trasposizione richiedono i Line)

Trasposoni a DNA, quindi di classe 2 -

Autonomi, vedono la presenza dei MULE e degli elitroni Non autonomi Mite, i quali restano fermi perché non hanno le trasposasi

I trasposoni a DNA, si spostano con un meccanismo di trasposizione taglia-incolla, la quale è una trasposizione conservativa, i retrotrasposoni invece attuano anch’essi un meccanismo a copia incolla, ma in più questi attuano una replicazione e questo processo di trasposizione comportando una replicazione porterà ad un massiccio incremento del numero di copie del retrotrasposone e di conseguenza anche della grandezza del genoma. I trasposoni di classe 2, quindi quelli a DNA vedono nelle loro zone terminali delle sequenze TIR, le quali sono le uniche ad essere presenti nei trasposoni MITE (i quali sono trasposoni a DNA non autonomi), e queste sequenze vanno a codificare per le trasposasi, l’enzima cardine al fine di avere la trasposizione. Oltre a questi abbiamo gli elitroni i quali non hanno TIRs, (Terminal Inverted Repeats) e non causano duplicazioni nel sito di inserzione, quindi sono difficili da trovare. Si inseriscono nel genoma a livello di sequenze AT, presentano TC in 5’e CTRR (R=purina) in 3’, e qui c’è una sequenza palindroma con basi appaiate e un loop intermedio di 2-4 bp non appaiate. Gli elitroni codificano proteine iniziatrici della replicazione, elicasi e RPA (replication protein A)-like, una proteina che lega il DNA a singola elica durante la replicazione. N.B.  Molti Helitron non sono autonomi ed hanno tutti un meccanismo di trasposizione “rolling-circle”, diverso da quello degli altri trasposoni a DNA I MULEs contengono frammenti genici (Pack-MULEs) anche appartenenti a geni differenti, cosi come gli elitroni sono in grado di causare exon shuffling. Probabilmente il basso numero di copie di MULEs ed elitroni è dovuto al fatto che sono prontamente silenziati e non hanno modo di amplificarsi e raggiungere un elevato numero di copie. Il fatto di portare frammenti genici e di essere espressi, fa sì che gli RNA chimerici prodotti servano alla regolazione epigenetica (silenziamento) di loro stessi e dei geni intatti da cui hanno acquisito i frammenti. Inoltre se, nel corso dell’evoluzione, i geni chimerici prodotti da tali trasposoni non determinano un vantaggio evolutivo per la pianta ospite, essi sono soggetti a mutazioni e delezioni che portano alla loro inattivazione e/o rimozione nell’arco di pochi milioni di anni. I trasposoni di classe 1, quindi i retrotrasposoni hanno una struttura molto simile a quella dei retrovirus, inoltre hanno al loro interno le sequenze GAG (codifica per il capside di protezione durante la trasposizione) e POL (dà la trascrittasi inversa e la proteasi), e questi trasposoni vanno a replicarsi tramite un meccanismo di trascrizione inversa, si ritiene che i retrovirus si siano originati dai retrotrasposoni in seguito all’acquisizione della sequenza ENV (che codifica una proteina del capside) e di altre sequenze che hanno permesso la mobilità extracellulare. I retrovirus hanno genomi di RNA a singolo filamento. Il suo ciclo vitale comporta uno stadio obbligato in cui il DNA a doppio filamento è inserito nel genoma dell’ospite tramite un evento simile alla trasposizione. Responsabile della generazione della copia iniziale di DNA dell’RNA virale è la trascrittasi inversa (RT), un enzima che converte l’RNA in un DNA duplex lineare nel citoplasma della cellula infettata, l’integrasi

invece è responsabile dell’integrazione. Il provirus viene trascritto dall’apparato dell’ospite e produce RNA virali, che servono sia da mRNA che da genomi che vengono impacchettati nei virioni. I retrotrasposoni sono simili ai virus e ai retrovirus. Essi si inseriscono in nuovi siti nel genoma della cellula ospite, utilizzando gli stessi passaggi di taglio del DNA e trasferimento del filamento dei trasposoni a DNA. A differenza di quest’ultimi però, la trasposizione per i retrotrasposoni passa attraverso un intermedio ad RNA. Questo processo che comporta un intermedio ad RNA è esclusivo degli eucarioti oltre ciò la principale differenza tra retrotrasposoni e retrovirus è che i retrovirus vengono impacchettati in un rivestimento proteico e formano particelle infettive, mentre i retrotrasposoni sono soltanto intracellulari. Invece i retrotrasponi non retrrovirali sono elementi poco trasponibili di DNA ripetuto, che si muovono tramite un RNA intermedio che è spesso prodotto a partire da un promotore nelle vicinanze; il trascritto di RNA ha l’estremità 5′ spesso troncata e la poli-A all’estremità 3′. Si muove grazie a trascrittasi inversa ed endonucleasi, e questi retrotrasposoni non-LTR non presentano sequenze ripetute alle estremità.

N.B. I retrotrasposoni possono essere raggruppati e inseriti uno dentro l’altro in un sito cromosomico, soprattutto in specie con genoma grande I retrotrasposoni non autonomi non hanno i domini GAG e/o POL, vengono distinti in TRIM (Terminal Repeats In Miniature) ed in LARD (Large Retrotransposon Derivatives) ed è stato proposto che le famiglie non autonome utilizzino per replicarsi gli enzimi prodotti da quelle autonome Bisogna sottolineare che gli elementi trasponibili provocano un aumento delle dimensioni del genoma! I retrotrasposoni in particolari condizioni sono in grado di attivarsi ed inserirsi in un nuovo sito del genoma, non sappiamo se e come i REs individuino precisi siti d’inserzione, tuttavia è si è osservato che questi hanno un ruolo strutturale e funzionale in centromeri, telomeri, e altre regioni eterocromatiche, con Gypsi che va ad occupare preferenzialmente regioni centromeriche e pericentromeriche e Copia, che sono più rari nei centromeri e presenti frequentemente nelle regioni subtelomeriche

L’inserimento di un elemento trasponibile può indurre nuova variabilità genetica, attraverso interruzioni della regione codificante, ma anche variazioni nei pattern di regolazione dei geni, attraverso interruzioni delle regioni regolatorie. Poiché i trasposoni sono potenzialmente altamente mutagenici, l’ospite ha sviluppato efficienti meccanismi epigenetici per controllare (inibire) la loro proliferazione, la maggior parte dei trasposoni sono inattivi, metilati e se trascritti, sono silenziati dai siRNA •

Silenziamento post trascrizionale tramite RNAi

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Alterazioni della cromatina mediate da RNAi

Per essere silenziati i trasposoni devono essere riconosciuti dal genoma ospite, ma i trasposoni hanno caratteristiche e sequenze differenti.Ciò che viene riconosciuto non è l’elemento trasponibile in sé ma ciò che esso produce, ovvero un RNA aberrante. Tale RNA è una molecola di RNA a doppio filamento (dsRNA) che viene processata in piccoli siRNA innescando il silenziamento del trasposone. Come si possono formare i dsRNA? 1) Trasposoni inseriti in regioni trascritte possono essere trascritti in direzione antisenso. Gli RNA prodotti possono appaiarsi con l’RNA senso creando dsRNA 2) Trasposoni con TIR o con porzioni duplicate e invertite 3) possono essere trascritti e il loro RNA formare loop di dsRNA simile a precursori di microRNA 4) In Retrotrasposoni “nested” in orientamento opposto, i promotori presenti nelle LTR possono produrre RNA senso e antisenso, favorendo la formazione di dsRNA

La trascrizione dei MITE (grazie alle TIR) o quella di due Retrotrasposoni adiacenti e opposti produce dsRNA che innescano il silenziamento tramite il DCL il RISC-AGO e la produzione di siRNA che vanno a silenziare il DNA tramite il rimodellamento della cromatina , la metilazione di istoni e di DNA (detta metilazione del DNA RNA dipendente)...