Verwerking nota\'s CW PDF

Preview

Summary

Samenvatting van het vak Cel en Weefsel met aan het eind van het bestand de beantwoorde hoofd- en bijvragen...

Description

Organisatie Atomen  moleculen  macromoleculen  organellen  cellen  weefsels  organen  orgaanstelsels  organisme

Begrippen Grootordes Wanneer je de vraag krijgt “hoe groot is een bepaalde zenuwcel?”, dan moet je dit antwoorden aan de hand van grootordes, dus nm, micrometer, cm etc. Deze grootordes moet je ook kennen! -

Maximale lengte skeletspier: enkele mm tot tientallen cm Mitochondriën: 0,2 micrometer

Oplossend vermogen/resolutie De minimale afstand die tussen 2 punten aanwezig moet zijn, opdat die 2 punten nog afzonderlijk van elkaar te zien zijn. Dit wordt bepaald door de golflengte, een constante en een product n * sin α. Hierin is α de halve tophoek van de apertuurkegel, n is de brekingsindex (in lucht 1) en sin is 1 voor een hoek van 90 graden. Dit kan je alleen nooit perfect voor elkaar krijgen, dus de numerieke apertuur (NA) in lucht is 0,95. Over het algemeen geldt hoe sterker de vergroting, hoe groter de α-hoek. -

Menselijk oog: 0,2 mm Lichtmicroscoop: 0,2 micrometer Elektronenmicroscoop: 0,2 nm

Vergroting Dit betekent dat je na vergroting nog steeds alles kan herkennen wat je zonder de vergroting ook zag. Hiervoor worden metalen roostertjes van 3mm gebruikt.

Klaren Doorzichtig maken/transparant maken.

Microscopische waarnemingsmethoden Weefselvoorbereiding Wanneer je een weefsel gaat bereiden, moet je in gedachte houden dat de structuren zo goed mogelijk behouden moeten blijven. De normen verschillen bij ieder niveau wat je wil bereiken. Nadat een organisme is overleden, zullen de weefsels al snel degenereren (orde van minuten). De eerste schade die je hierbij gaat zien is dat de mitochondriën kapot zullen gaan, dit is onder een LM minder cruciaal dan onder een EM, want de diameter van mitochondriën is 0,2 micrometer en dit is precies de grens van een LM. De vereisten aan LM zijn dus veel minder streng dan voor EM. Voor fixeren kan je gebruik maken van immersie of perfusie. -

Immersie: onmiddellijk uitnemen en in fixatievloeistof onderdompelen Perfusie: narcose  canule in bloedbaan  bloed uitvloeien  fixatief via bloedbaan ter plekke laten brengen

In levende cellen is dit niet mogelijk. Ook is de manier van preparaten maken verschillend. Zo gaat een bloeduitstrijkje heel anders in zijn werk dan bij andere cellen. Chemische fixatieven die gebruikt worden zijn paraformaldehyde en flutaaraldehyde.

Microscopen Sterke loep Van Leeuwenhoek gebruikte in zijn experimenten een zeer sterke loep. Deze is echter niet bedoeld voor celbiologische zaken, dus deze is voor ons niet van sprake.

Lichtmicroscoop (LM) Dit type microscoop maakt gebruik van optische lenzen en dus ook van de golflengte van licht. Je kan maximaal 1000 keer vergroten en het oplossend vermogen is 0,2 micrometer. Deze microscoop gebruikt de lenstheorie, welke hieronder beschreven staat. Het is een combinatie van een vergrootglas en een diaprojector en een projectie resulteert in een virtueel, gekleurd beeld. Het oculair zorgt voor een vergroting van het beeld en projectie op het netvlies van het oog. Een objectief vormt het tussenbeeld en bepaalt grotendeels de vergroting. Een condensor bundelt licht op het preparaat.

Elektronenmicroscoop (EM) Dit type microscoop heeft een oplossend vermogen van 0,2 nm en maakt gebruik van elektronen ipv licht. Omdat de golflengte van elektronen 100.000 keer kleiner is dan die van licht, kunnen er veel sterkere vergrotingen gebruikt worden. Je maakt hierin gebruik van elektromagnetische lenzen. Omdat er echter een correctie nodig is, zal er maar 1/1000 verschil zijn met een lichtmicroscoop, omdat de correctie een negatieve impact heeft. Omdat er gebruik gemaakt wordt van elektronen moet alles onder vacuüm gebeuren, anders zullen de elektronen botsen met gasmoleculen. Elektronen worden op het preparaat gebombardeerd en kunnen geabsorbeerd, verstrooid of gereflecteerd worden. Wanneer je preparaten gaat maken voor elektronenmicroscopie, zal je een iets andere methode moeten gebruiken dan bij lichtmicroscopie. Je zal het eerst moeten fixeren door middel van immersie of perfusie, dit gedeelte is gelijk aan de LM. Vervolgens is er postfixatie nodig, dit gebeurt dmv immersie door osmiumtetroxide te gebruiken. Hierna zal je moeten ontwateren om vervolgens in te bedden in hars. Hierna ga je trimmen en ultradunne sneden snijden. Dit is noodzakelijk, omdat je anders kans hebt op een onscherp beeld. Ten slotte ga je contrasteren. Ook is het mogelijk om te fixeren door in te vriezen met vloeibare stikstof. Je krijgt op dit moment een vitrificatie van cellen: invriezen zonder de vorming van ijskristallen. Je kan een verschil maken tussen een TEM en een SEM. -

-

Transmissie elektronen microscoop o Gebaseerd op dezelfde basisprincipes als lichtmicroscopie o Gebruikt elektronen als lichtbron o Alles moet onder vacuüm gebeuren, omdat anders de elektronen botsen met gasmoleculen o Elektromagnetische lenzen o Elektronen worden op het preparaat gebombardeerd en kunnen worden geabsorbeerd, gereflecteerd of verstrooid o Belang van een dun preparaat o Vergrotingen tot 450.000x en resolutie 0,1 nm Scanning elektronen microscoop

o

o o

o

Maakt gebruik van het wegschieten van elektronen van het oppervlak van een preparaat Een zogeheten spot beweegt lijn voor lijn Secundaire elektronen geproduceerd die opgevangen worden in een detector Vergrotingen tot 80.000x en resolutie < 6 nm

Lenstheorie De lenstheorie, of lenzenformule, is een formule uit de geometrische optica die het verband beschrijft tussen de beeldafstand, de voorwerpafstand en de brandpuntsafstand van een lens. De brandpuntsafstand is het focuspunt van de lens, deze zit zowel voor als achter de lens. Wanneer je je vergrootglas in de zon houdt, zal je alle stralen van de zon focusseren op 1 punt en wanneer je je object in een brandpunt zet, gaat de lens deze stralen naar oneindig sturen. Alle lichtstralen die door het centrale punt van een convexe lens gaan, zal niets mee gebeuren. Afhankelijk van waar je je object neer zet krijg je het volgende beeld: -

Tussen brandpuntafstand en 2 * brandpuntafstand: reëel vergroot omgekeerd beeld Afstand verder dan 2 * brandpuntafstand (landschap): reëel verkleind beeld In 2* brandpuntafstand: reëel omgekeerd beeld op gelijke grootte

Lens Op een afbeelding van een lens zal je de volgende dingen tegenkomen: -

Plan-APOCHROMAT: lenscorrecties (ook voor kleuren) 0,17: dikte van het dekglaasje in mm waarvoor de lens gecorrigeerd is 1,4: numerieke apertuur

Resolutie Ieder lichtpuntje wordt ergens geprojecteerd; niet als een punt, maar als een “airy disk”. Je ziet centraal een hotspot van 2 punten met daaromheen een aantal minder intense ringen. Wanneer je 2 punten hebt die ver genoeg van elkaar liggen, is er een contrastverschil te zien en zijn er 2 punten zichtbaar. Dit noem je resolved. Wanneer je 25% intensiteitsdaling hebt, dan bepaalt dit de resolutie van ons zicht, maar is het nog wel waar te nemen. Hier is er sprake van een rayleigh limit.

Preparatie van paraffinecoupes Voor de preparatie van de coupes zal je eerst moeten fixeren, vervolgens ontwateren en ten slotte kleuren.

Ontwateren Omdat je het weefsel moet inbedden in parafine (was), moet het eerst ontwaterd worden. Was is namelijk waterafstotend. Je gebruikt parafine omdat je vervolgens coupes zal moeten maken, en dit gaat gemakkelijk op deze manier. Dit wordt zowel voor lichtmicroscopie als voor een transmissie elektronenmicroscoop gebruikt. Bij gewone elektronenmicroscopen wordt dit ook gebruikt, maar dan op een andere manier. Uiteindelijk kom je tot een toestand waar het weefsel op een microtoom gefixeerd is. Het weefsel is op dit moment 5 micrometer dun en het zal opgevangen worden op draagglaasjes. Op deze manier kan je het onder de microscoop leggen, maar er zal niet veel te zien zijn omdat biologisch materiaal weinig contrast inhoudt. Hierom is het noodzakelijk om het weefsel te kleuren.

Kleuren Kleurstoffen zijn waterige structuren, dus na het ontwateren zal je terug moeten gaan naar een waterige oplossing. Vervolgens na het kleuren kan je in principe al een dekglaasje erop leggen, maar dit wordt meestal niet gedaan omdat dit een dag later uitgedroogd zal zijn door het waterige milieu. Daarom ga je het ten slotte in een inbeddingsmedium leggen zodat uitdroging niet meer mogelijk is; je gaat dus voor een laatste keer ontwateren. De meest routinematige overzichtskleuringen zijn HE, Azan, Trichroom, Orceïne. -

Tussen Trichroom en Azan kan er verwarring voorkomen, omdat de kernen van trichroom niet zwart maar rood kunnen kleuren na een onjuiste kleuring Orceïne is een meer specifiek kleuringsgeheel, gebruikt voor elastisch bindweefsel

Meer specifieke kleuring kan bekomen worden met antilichamen, dit gebeurt in een techniek die de immunocytologie heet.

Contrastverhogende technieken Veel kleurstoffen zijn toxisch voor levende cellen, daarom bestaan er contrastverhogende technieken. Deze technieken zorgen ervoor dat levende cellen toch veilig zichtbaar gemaakt kunnen worden.

Fasecontrastmicroscopie Deze techniek wordt gebruikt om in levende cellen nog inwendige structuren te kunnen onderscheiden. Je kan structuren herkennen zonder dat het gekleurd is, door een illusie van dieptezicht.

Differentiaal interferentiecontrast Dit maakt gebruik van de principes van polarisatiemicroscopie.

Fluorescentiemicroscopie Via deze techniek kan je bepaalde structuren labelen met zeer specifieke antilichamen, waardoor je structuren en processen in biologische samples kan detecteren en visualiseren. Je hangt als het ware fluorescente lampjes eraan. Je maakt gebruik van fluorochromen; wanneer je ze aanstraalt met licht van een bepaalde golflengte, ga je ze in een geëxciteerde toestand brengen. Ze zullen teruggaan naar een grondstatus waarbij ze licht uitzenden, maar in dit geval licht van een langere golflengte. De basis van fluorescentiemicroscopie is het volgende: wanneer je FITC (Fluorescine isotyne cyanaat) belicht met rood licht gebeurt er niets, met blauw licht wordt het geabsorbeerd. Met een kleine vertraging gaat het licht met een groene golflengte uitzenden.

Het verschil in maximale golflengte tussen geabsorbeerd en uitgezonden licht wordt een Stokesshift genoemd. In de fluorescentiemicroscopie worden ofwel lasers ofwel kwiklampen gebruikt, er is namelijk een veel hogere intensiteit nodig dan bij een gewone lichtmicroscoop. Het licht zal op een preparaat gezonden worden via een dichroïsche spiegel die onder een bepaalde hoek (45°) staat. Het is mogelijk om hiertussen filters te plaatsen die maar een enkele kleur licht doorlaten. De spiegel heeft als eigenschap dat deze licht onder een bepaalde waarde niet doorlaat, boven deze waarde zal hij wel alles doorlaten. Bepaalde structuren zijn al fluorescent van zichzelf, bijvoorbeeld rood licht. Wanneer je niet wil dat dit je uiteindelijke beeld verstoort, is het mogelijk om een extra filter te plaatsen. Hierbij moet je wel onthouden dat hoe meer filters je plaatst, hoe minder licht er doorgelaten zal worden. Omdat dit zo’n precieze techniek is, zullen de objectieven van nog hogere kwaliteit moeten zijn dan die van de andere microscopen. Ook zal je tijdens dit geheel in een donkere ruimte moeten zitten, om het weinige licht dat aanwezig is allemaal op te kunnen vangen. De fluorochromen zullen exciteren en na een aantal minuten zal alles weg zijn. Dit komt ook niet meer terug en het preparaat zal gebleekt worden als gevolg. Je zal dus moeten kijken, meteen een foto moeten nemen en daarna weer verder moeten gaan. Veel tijd heb je niet. Een aantal structuren zijn uit zichzelf al fluorescent, dit wordt autofluorescentie genoemd. Een voorbeeld hiervan zijn de planten, die chloroplasten bevatten.

Immunohistochemische kleuring Dit type kleuring is gebaseerd op het eigen afweersysteem. Wanneer je lichaam vreemde partikels binnenkrijgt gaat het lichaam antilichamen aanmaken. Deze gaan complexeren met lichaamsvreemde partikels en antigenen vormen. Je moet er echter rekening mee houden dat er altijd een paar aspecifiek zullen binden.

Confocale microscopie Laser scanning Bij gewone fluorescentiemicroscopie wordt het beeld gevormd door emissielicht afkomstig van de volledige dikte van het preparaat. Hierdoor krijg je een out-of-focus blur, oftewel een wazig beeld. De oplossing die hierop is gevonden is het gebruik van pinholes. Dit zorgt ervoor dat het licht preciezer op het oppervlak kan vallen wat je wil bekijken. Over het algemeen worden er 2 pinholes gebruikt. 1 wordt geplaatst aan de lichtbron, deze zorgt ervoor dat de regio waarvan je een beeld wil vormen belicht wordt. Een tweede pinhole plaats je voor de detector, waardoor alleen het licht vanuit het focale punt de detector bereikt. Het licht dat boven en onder het focusvlak ligt wordt niet betrokken in de beeldvorming. Spinning disk Bij deze variant wordt gebruik gemaakt van een Nipkow disk. Deze disk zal rond gaan draaien, waardoor je excitatie krijgt met vele kleine lichtbundeltjes. Op deze manier zijn real time beeldopnamen mogelijk en is er minder fototoxiciteit.

Vriescoupes Paraffinecoupes betekenen automatisch dat je het weefsel zal moeten opwarmen tot 58 graden, omdat het paraffine pas op deze temperatuur vloeibaar is. Voor veel antigeen – antilichaam bindingen is dit echter desastreus, en daarom wordt hiervoor parafine ook niet gebruikt. In dit geval zal je vriescoupes gaan gebruiken. Je gaat weefsels vastleggen in een ingevroren substantie om vervolgens vriescoupes te kunnen bekijken. Omdat het hard is door het invriezen, kun je er ook kleine plakken van snijden.

Levende organismen Wanneer je op vertakkingen kijkt, krijg je structuren die ook zichtbaar zijn in fluorescentie. Dit is naast een kleuringstechniek ook een calciumindicator, waardoor je verschillen in de calciumspiegel kan opmerken. Wanneer de intracellulaire calcium stijgt, zal het oplichten. Dit betekent dat de cel geactiveerd wordt en op deze manier kan je nakijken of bepaalde stimuli een effect hebben in een cel. Dit wordt ook wel calcium imaging genoemd. Ook hebben we zeer specifieke organel-labels tot onze beschikking, waardoor we onder andere de mogelijkheid hebben om reportergenen te labelen. Via deze genen kan je bepaalde structuren intrinsiek zichtbaar maken. Het bepaalde gen wat je wil bestuderen koppel je aan het reportergen, vervolgens zal je transcriptie krijgen en krijg je het eigenlijke eiwit met een GFP (green fluorescent protein) label. Dit breng je in in RNA, waardoor een eiwit geproduceerd wordt. Dit eiwit wordt ingebouwd in een membraan waardoor licht aangestuurd zal worden. Op de plaats van het eiwit zal dus een fluorescentiesignaal optreden. Op deze manier kan je bepaalde eiwitten volgen om te kijken waar ze ingebouwd worden. Mitochondriën zullen continu fuseren en opsplitsen en zijn dus heel actieve structuren.

Cytologie Grootordes -

Gemiddelde dierlijke cel: 20 micrometer Bacteriën: 1-2 micrometer Ribosoom: 25 nm Dikte celmembraan: 7-8 nm DNA-helix: 2 nm Microfilament: 7 nm Microtubuli: 25 nm Tubulinedimeren: 5 nm Intermediaire filamenten: 10 nm

Gemeenschappelijke kenmerken De genetische informatie is opgeslagen in DNA. Voor elke celdeling wordt deze gedupliceerd en doorgegeven aan de dochtercellen. Wanneer je vertrekt vanuit het gen, zal dit via transcriptie omgezet worden naar mRNA. Dit wordt via translatie vertaald naar een eiwit en vervolgens vrijgezet in organellen of in het cytoplasma. Ze zullen plooien naar een quaternaire structuur, waardoor het biologisch actief kan worden. Hier kan echter veel misgaan in de vorm van mutaties. Membranen groeien door expansie van reeds bestaande membranen. Cellulaire bestanddelen worden naar hun juiste locatie binnen (of buiten) de cel geleid door middel van signaal-receptor interacties. De cellulaire bestanddelen bewegen door diffusie, moleculaire pompen en motor-proteïnen.

Celorganellen Ribosomen De nucleolus is de plaats waar RNA, ofwel de bouwstenen van ribosomen gevormd worden. Een aantal elementen, vertrekkende van DNA, zijn hier aanwezig. Elk rRNA-gen is een enkele

transcriptie-unit die de 18S, 5,8S en 28S rRNAs en de overgeschreven spacersequenties bevat. De rRNA genen zijn geordend in rijen van 2 die van elkaar gescheiden zijn door niet-overgeschreven spacer-DNA. Hierin staat S voor Svettberg units, dit is een sedimentatiewaarde. Enerzijds vindt er transcriptie plaats door het toevoegen van eiwitten, waardoor ribosomale eiwitten gevormd worden die in het cytoplasma gemaakt zijn. Anderzijds worden ze weer terug geïmporteerd en zullen ze bijdragen aan de grotere subeenheid van het ribosoom. Kleinere ribosomen bevatten 40S, dit is minder zwaar. Wanneer het samengevoegd wordt in het cytoplasma, krijg je een functioneel ribosoom. Ribosomale eiwitten worden vanuit het cytoplasma naar de nucleolus gebracht en beginnen zich daarna te hechten aan het pre-rRNA nog voor het zich splitst. Tijdens de verdere verwerking van het pre-rRNA worden er nog een aantal ribosomale eiwitten en het 5S-rRNA toegevoegd, waardoor er preribosomale partikels ontstaan. Tijdens de laatste stadia van het rijpingsproces migreren de preribosomale partikels zich uit de nucleolus naar het cytoplasma en ontstaan zo de 40S en 60S ribosomale subeenheden. Voor de eukaryoten geldt een sedimentatiewaarde 40S en 60S, voor de prokaryoten is dit 30S en 50S. De ribosomen bevatten een zestal overige structuren. -

-

Cajalbodies o Stippen van een aantal micrometer o Zijn betrokken bij de regulatie van bepaalde RNA genen GEMs o 2 geassocieerde cajalbodies Nucleair bodies o Bevinden zich vooral in kankercellen PML o Promeolocytic leukemia Speckles o Kleinere structuren in de kern, functie is onduidelijk snRNP o Snurps o Verwijdering van introns bij pre-mRNA o Small nuclear ribonucleoprotein particles

Endoplasmatisch reticulum Ruw Dit is als het ware een eiwitfabriek waar de basis van de eiwitvorming gebeurt. Het is aan te treffen in alle eukaryotische cellen. Het bevat een zeer nauwe relatie met het Golgi Apparaat, want het verzorgt afwerking en uitsturen naar de uiteindelijke bestemming. Materiaal wat aangeleverd wordt vanuit het rER wordt via transportvesikels naar het GA gestuurd, hier gebeurt de verdere verwerking van producten. Het speelt een rol in de biosynthese van eiwitten, een aantal enzymen en de aanmaak van componenten is belangrijk voor membranen, want het is de plaats waar de extracellulaire matrix wordt aangemaakt. Vroeger werd het de trichroïde substantie genoemd, omdat er een vlekkenpatroon in de cellen zit. Toen was er echter nog geen elektronenmicroscoop, waardoor ze niets van de Nissl-substantie afwisten.

Later bij het ter beschikking stellen van de elektronenmicroscoop bleek dit het rER te zijn. Alle eiwitproducerende cellen bevatten een uitgebreid rER. Het is van belang dat de inhoud die ingekapseld is door een membraan niet zomaar vrij uitgestort kan worden in het cytoplasma. Hierom worden de cellen die bedoeld zijn voor export of secretie door het Golgi Apparaat naar buiten gestuurd. Vanuit het RNA gebeurt er een vertaling/overschrijving van een genetische code via tripletten. Thv de ribosomen wordt dit getranscribeerd en getranslateerd naar DNA of RNA. Ribosomen worden gevormd vanuit de nucleolus en komen dan in het cytoplasma. Het eerste dat afgeschreven wordt is een soort signaalsequentie die herkend gaat worden door een SRP (single recognition particle). Hierdoor zal het ribosoom met het mRNA geleid worden naar de membraan van het ER. Het SRP gaat binden aan de receptor of aan een integraal eiwit dat in de membraan van de cisternen (ruimte tussen 2 membranen) zit. Je spreekt hier van een docking- of looseiwit. Wanneer de binding gebeurd is, ga je een gevolg krijgen: -

Het signaal peptide wordt afgesplitst Het eigenlijk peptide dat bedoeld was om gesynthetiseerd te worden gaat zich plooien en zo wordt de synthese van een eiwit in het ER naar b...