ZMB Selbstkontrolle - Übungsaufgaben PDF

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Übungsaufgaben...

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VL 1 - Einführung Metabolismus - Stoffwechsel = Anabolismus (Aufbau organischer Moleküle) + Katabolismus (Abbau unter Energiegewinnung) Nukleotidaufbau Zucker: Pentosen D-Ribose/2-Desoxyribose Nukleosid = Zucker + Base Nukleotid = Nukleosid + Phosphat(e)

Basen entweder Purin- oder Pyrimidenbasen

Nukleotidbiosynthese ➜ de novo = Purine/Pyrimidine aus einfachen Bausteinen (AS, NH4 +, CO2) gebildet ○ Pyrimidin über UMP (PRPP, Asp, HCO3-, Gln) ○ Purin über IMP ■ Autoregulation ??????? ➜ Slavaging = Basenwiederverwertung ➜ Zuckerphosphatanteil immer von aktivem Donor PRPP (5-Phosphoribosyl-1-Pyrophosphat) THF - Tetrahydrofuran Purinabbauprodukte Harnsäure (Primaten, Reptilien Vögel, Insekten) / Harnstoff (Amphibien) / CO2 2NH3 (marine Invertebraten) ➜ bei defektem Abbau Severe combined immune deficiency SCID Wo kommen Nukleotide außer in Nukleinsäuren noch vor? Nennen Sie Beispiele. ➔ FADH ➔ NADH

VL 2 - DNA - Struktur Schreibweise Oligo-/poly-nt immer von 5´-3´Richtung 5´ P Gruppe 3´OH Gruppe DNA um basische Histonprotein aufgewickelt (bildet somit Nukleosom) Funktion der DNA ➔ Träger der Erbinformation ➔ steuert eigene Replikation bei Zellteilung

➔ steuert Transkription der komplementären RNA Funktion der RNA ➔ steuert Translation (mRNA) ➔ sind Teil der Ribosomen (rRNA) ➔ liefern Aminosäure bei Translation (tRNA) ➔ sind Bestandteil von Ribonukleoprotein-Partikeln (RNP) ➔ bei viele Viren Träger der Erbinformation (= gleiche Funktion wie DNA) Chargaff Regel ➔ Verhältnis A:T bzw. G:C immer 1:1 ◆ A=T und G=C ◆ A+G = T+C ◆ A:T = 1:1 und G:C = 1:1 ➔ Verhältnis A+T / G+C variiert von Organismus zu Organismus ➔ Basenzusammensetzung charakteristisch für Organismen Watson-Crick-Modell der DNA ● B-Form der DNA ● d = 2nm, rechtshängig ● Basen inne, Phosphate aussen ● Fläche der Basen nahezu senkrecht zur Längsachse ● Komplementäre Basenpaarung, d.h. Verknüpfung zur Doppelhelix erfolgt nur über H-Brücken ● DNA-Stränge sind antiprallel orientiert ● Watson-Crick-Modell lässt auf Grund seiner Geometrie nur 2 Typen von Basenpaaren zu; dadurch bedingt, dass Basen sich wechselseitig ersetzen können ● Stränge sind so verdrillt, dass Trennung nicht ohne Aufwindung der DNA möglich ist ● große & kleine Furche -> Bildung an der Außenseite der DNA Kriterien

A-Form

Z-Form

B-Form

Form: Relative Feuchtigkeit: Windungsrichtung: Höhe pro Bp: Durchmesser der Helix: Bp pro Windung: glycosidischen Bindung: Ganghöhe: Vorkommen:

breit & kurz 75% („trockene DNA“) rechtsgängig 0,23 nm 2,55 nm 11 BP anti 2,53 nm doppelsträngige Regionen von RNA bzw. RNA/DNA-Hybride extrem tief extrem flach

lang & schmal 66% linksgängig 0,38 nm 1,84 nm 12 Bp anti & syn 4,56 nm DNA-Segmente; Methylierung von Cytosin am C5

breiter als Z; schmaler als A 92% rechtsgängig 0,34 nm 2,37 nm 10,4 Bp anti 3,54 nm

flach sehr schmale & tief

weit & tief eng & tief

Neigung der Bp-Ebene um 20° gegen Achse

relativ zur B-DNA Bp um 180° gedreht Verbindungslinien aufeinanderfolgender Phosphatgruppen verläuft im Zickzack

große Furche: kleine Furche:

VL 3 - Eigenschaften der DNA UV - Absorption ➔ DNA absorbiert UV - Licht zwisch 260 nm & 280 nm (Aktionsspektrum für Mutationen am größten) ➔ 34. Anschlussfrage: Warum? ➔ Abhängigkeit von T: Proteine denaturieren, physikalische Eigenschaften ändern sich -> hyperchromer Effekt (um 40% höhere Warscheinlichkeit) infolge von Aufhebung WW zwischen Elektronen benachbarter Basen, d.h. Ds gehen auseinander; Basen gehen verloren ➔ T(m) - Schmelztemperatur = DNA ist zu 50% geschmolzen ➔ T(m) ist abhängig von Art & Konzentration der Ionen in Lösung; pH-Wert; G/C-Gehalt Denaturierung - WW zwischen den Basen lösen sich auf; DNA - Stränge werden voneinander getrennt Renaturierung - Komplementäre Einzelstränge werden u Ds; Vollständig bei längerer T T= – 26 ° C (darf nicht zu schnell abkühlen ! ) → desto höhere v, umso komplexer das Genom Hybridisierung - mittels Renaturierung werden ähnliche Sequenzen verschiedener Arten identifiziert - Grundlage vieler Methoden der Gentechnik (PCR, Blots …) Superspiralisierung - Doppelhelix gewunden um eine Achse jede weitere Windung dieser Achse um sich selbst ➔ Kontrolle mittels Topoisomerasen I : Einzelstrangbrüche & Topoisomerase II : Doppelstrangbrüche

VL 4 - Vorkommen der DNA in Pro- & Eukaryoten ! Genom - vollständige genetische Information; in einem einzelnen, meist zirkulären Molekül enthalten Vorkommen von DNA - Prokaryonten ➔ Genom = Viren (DNA,RNA); Bakterien ( meist kovalent geschlossenes, ringförmiges Molekül) ➔ Plasmide = extrachromosomale Element, Träger zusätzlicher genetischer Information Vorkommen von DNA - Eukaryonten ➔ Chromosomen = verpackte lineare DNA im Zellkern; je ein lineares ds DNA-Molekül enthalten ➔ Mitochondrien = ringförmig, ds Molekül; 0,1 % Anteil an der Gesamtzell-DNA ➔ Chloroplasten = ringförmig, ds ! Chromatin - spezieller Komplex aus DNA & Proteinen (Histonen) ! Histone - Proteine → Aufwicklung der DNA zu Chromatin ➔ H2A/H2B & H3/H4 (! Histon-Core = 4 Histonproteine) → einzeln bilden sie ein Dimer; zusammen Oktamer bei der Entstehung von Nukleosomen (Histonproteine + DNA) ➔ H1 → nur kleine Mengen in der Zelle enthalten ! Pertschmer Struktur - Aufgewickelte Form der DNA um Histone zu Nukleosomen ! “NHP” = Nicht-Histon-Protein → an bestimmte DNA sequenzen gebundene heterogene Proteine; kondensieren zu chromatinfasern bzw. chromatinbündeln; gewebsspezifisch ! Heterochromatin - hochspiralisierten & Gen-armen Anteil des Nukleinsäurenstranges Bsp. zu finden beim Menschen im Zellkern Bildung Riesenchromatin - vielfach endomitotische Verdopplung der Chromosomen, ohne dass Chromatiden sich voneinander trennen Anschlussfrage: In welchen Mengenverhältnissen liegen diese vor?

VL 5 - Replikation zentrales Dogma der Molekularbiologie - Schema der Informationsübertragung vom Gen zum Protein ! semi - konservative Replikation ➔ identische Verdopplung der DNA ➔ neu gebildeten Doppelstränge = ein neuer + ein alter Einzelstrang ➔ Einzelstrang diente als Vorlage um die komplementären Basen anzulagern Meselson - Stahl - Experiment ➔ Nachweis für die semikonservative Replikation der DNA 1. Wachstum der Bakterien in einem Medium mit schweren Stickstoff (15N) 2. Transfer Medium mit leichtem Stickstoff (14N) a. 2 Hybrid DNA Doppelstränge (15N/14N) → 1.Tochtergeneration b. 2 Hybrid DNA Doppelstränge + 2 neue DNA Doppelstränge (14N) → 2.Tochtergeneration 3. extrahierte DNA mittels Zentrifugation aufgetrennt ! Replikationsursprung (ORI) - Startpunkt der Replikation DNA-Replikation bei Prokaryonten ➔ SSB-Proteine = stabilisieren Einzelstrang, verhindern das zusammenlagern der Einzelstränge ➔ Topoisomerase = vermindert durch Einzelstrangbrüche topologischen Stress ➔ Helicase = entwindet Doppelstrang ➔ Primer = kleines RNA-Stück von Primase ➔ Primase = synthetisiert Startpunkt für DNA Polymerase III am Folgestrang ➔ DNA - Polymerase I = füllt Lücken zw. Okazakifragmenten, proofreading ➔ DNA - Polymerase III = Hauptprotein der Replikation; baut neuen Strang in 5’-3’ Richtung ◆ Leitstrang = kontinuierlich ◆ Folgestrang = diskontinuierlich

➔ Telomerase = baut Sequenzen an 3’ Ende, damit DNA nicht verkürzt wird ➔ Ligase = schließt Lücke zwischen Okazakifragmenten

VL 6 - Replikation & Reparatur Exonuclease - brauchen zum Arbeiten ein offenes Ende Endonuclease - können jede Art von DNA schneiden Welche DNA-abhängigen DNA-Polymerasen gibt es bei E. coli? ➔ DNA Polymerase I -> Polymeraseaktivität: Synthese von kurzen Nukleotidstücken ◆ Exonucleaseaktivität: ● 5’-3’ Ende: Entfernung des Primers der RNA Polymerase & ersetzt diese durch DNA Nukleotide ● 3’ - 5’ Ende: proof reading -> entfernt falsche Nukleotide und ersetzt diese ◆ Umsetzung von 50 Nukleotiden pro sek ◆ schließen der Lücken zwische Okazakifragmenten, Nicktranslation ➔ DNA Polymerase II ◆ Umsetzung von 50 Nukleotiden pro sek ◆ schließen Lücken in DNA Strängen ◆ SOS Reparatur ➔ DNA Polymerase III -> Hauptenzym der Polymerisation der Replikation -> hängt Nukleotide an freies 3’ Ende ◆ Exonucleaseaktivität: 3’ - 5’ Ende proof reading ◆ Umsetzung von 1000 Nukleotide pro sek Kennen Sie weitere Polymerasen? Nennen Sie wenigstens drei Beispiele und nennen Sie eine Besonderheit bzw. einen Unterschied zu den E. coli-Polymerasen. 1. Klenow Fragment 2. Taq-Polymerase = thermostabil 3. Reverse Transkriptase = 4. RNA-Polymerasen 5. Telomerase Zahlreiche DNA-Polymerasen (ca. 15), die wichtigsten sind: α, β, γ, δ, ε 1. α: Primase 2. β: Reparatur (überwiegend) 3. γ: Replikation/Reparatur von mtDNA 4. δ,ε: primäre Replikationsenzyme (lagging/leading strand) ! keine der eukaryont. DNA-Polymerasen kann die Primer entfernen Versuchen Sie in kurzen Worten zu beschreiben, warum es trotz Proofreading- und Reparatur-Funktionen zu Mutationen kommen kann. ➔ Mutagene ➔ DNA Polymerase III reduziert Fehlerrate um 99% → jede 1000. Replikation = fehlerbehaftet ➔ Fehlpaarung beim crossing over der Meiose ➔ Frameshift = falsches ablesen der DNA Sequenz Nennen Sie wenigstens drei verschiedene äussere Einflüsse die zu DNA-Schäden führen können. Welche Schäden entstehen dabei? 1. UV-Strahlung = Pyrimidindimere → benachbarte Pyrimidine (meist TT, seltener CC oder CT) werden kovalent miteinander verknüpft 2. alkylierende Agentien = Basen werden verändert 3. interkalierende Agentien = Deletion, Insertion 4. ionisierende Strahlung = veränderte Basen; induzierte Strangbrüche Was tut die Photolyase (Photoreaktivierung)? ➔ bindet an Thymindimer (Pyrimidindimer) unter Einwirkung von sichtbaren Licht wird der Cyclobutanring gespalten → Thymindimer wird gekappt → normale Basenpaarung hergestellt → DNA repariert

Welcher Reparaturmechanismus ist bei Pro- und Eukaryonten sehr ähnlich angelegt? Skizzieren Sie kurz den Ablauf. (siehe Folie 24) ➔ Nukleotid-Excisionsreparatur (NER) ➔ Endonukleasen erkennen Schaden an Verformung der Helix-Struktur ◆ Schneiden 8 nt 5  und 4 nt 3  vom Dimer ◆ Reagieren auch bei anderen Schäden, wenn Helix verformt

VL 8 - Posttranskriptionelle Modifikation, Splicing, genetischer Code Wozu dienen die Transkriptionsfaktoren, warum werden diese gebraucht? RNS-Poly II kann Promotor nur mit TFII (Initiationsprotein) erkennen Eukaryontische Gene sind "unterbrochen" – heisst das, sie sind kaputt? ➔ Translationsprodukt keine 1:1 Übersetzung der genetischen Information ! Exon - codierender Abschnitt; werden exprimiert also translatiert ! Intron - nicht codierenden Sequenzabschnitte innerhalb des Gens; liegen innerhalb intra Splicing ➔ Ort = mRNA ➔ Entfernung der Introns aus dem primären Transkript ➔ neue entstandene Enden müssen miteinander verbunden werden Skizzieren Sie grob ein Intron mit flankierenden Exons, markieren und beschriften Sie die für das Splicing relevanten Stellen. Was ist deren Funktion? ! snRNP - small nuclear ribonucleoprotein particle → mitwirken beim Splicing der Introns ➔ U1 bindet an 5’ Splice Seite ➔ U2 bindet an branch site & bildet einen Teil des katalytischen Centers ➔ U4 unterbindet/verdeckt die katalytische Aktivität von U6 ➔ U5 bindet an 5’ Splice Seite ➔ U6 katalysiert spleißen siehe Folien 12 bis 19

Werden auch die anderen eukaryontischen RNAs "prozessiert"? Geben Sie ein Beispiel. ➔ Transkript von rRNA- und tRNA-Genen werden nach der Synthese prozessiert ➔ rRNA = funktionale Sequenze werden in mehreren Schritten aus dem gemeinsamen Vorläufer herausgeschnitten ➔ tRNA = am 5’-Ende wird die sog. Leader Sequenz entfernt; am 3’-Ende wird zusätzlich CCA angehängt Warum muss der genetische Code mindestens ein Triplett-Code sein? Was ist die Folge? ➔ 4 Basen in DNA/RNA und 20 AS ➔ Duplett Code: 42 = 16 Möglichkeiten AS ➔ Triplett Code: 43 = 64 Möglichkeiten AS → ausreichend aber mehr als notwendig → degenerierter Code Sind alle Tripletts codierend und haben alle Tripletts nur genau eine Bedeutung? Benennen Sie die Ausnahmen und deren Funktionen. ➔ ! Leseraster - zusammenhängende, nicht überlappende Sequenz von Basentripletts auf der DNA oder mRNA bezeichnet ➔ Leseraster überlappen Wie wird aus einem Codon eine Aminosäure? Nennen Sie den Vermittler. tRNA, Ort Ribosomen Wie wird geregelt, dass eine Aminosäure jeweils nur an genau eine tRNA, nämlich die mit dem richtigen Codon bindet? spez. Basentriplett (-code) bindet an tRNA und wird zum Ribo transportiert In welcher Richtung wird die Proteinkette synthetisiert? 3´ nach 5´APE Stellen beachten

Welche Aminosäure wird bei Prokaryonten üblicherweise als erste eingebaut? Anschlussfrage: Wie unterscheidet sich diese von der "normalen" Form? Anschlussfrage: Wozu dient das? Methionin = 1. AS und Start der ASKette Was ist eine "Shine-Dalgarno-Sequenz? Anschlussfrage: Wo kommt diese vor? Startpunkt Translation, Sequenz auf mRNA der Prokaryoten für richtige Positionierung des Ribosomes; komplementär zur rRNA 30S-Untereinheit Was versteht man allgemein unter "Consensus-Sequenz"?

Nucleotide oder Aminosäuren ähnlicher oder identischer Art an gleichen Positionen in miteinander verglichenen Sequenzen unterschiedlicher Moleküle (Fleißarbeit oder Software) gleiche biologische Funktion (bspw. TATA-Box, Shine-Dalgarno-Sequenz) Nennen Sie die wesentlichen Bestandteile des Initiationskomplexes bei Prokaryonten. Was ist die "A-Site", was die "P-Site"? Wofür stehen die Abkürzungen, was ist deren Funktion? Welche Funktion hat EF-Tu? Was ist ein "Release-Faktor"? Was tut er?

VL 9 Posttranslationale Modifikation bei Eukaryoten Nennen Sie Beispiele für Aktivierung durch Proteolyse. Protein zunächst inaktiv, aktiviert durch proteolyt. Spaltung (Proteasen) - Trypsinogen →Trypsin - Chymotrypsinogen → Chymotrypsin Prokollagen → Kollagen Reifungsvorgang von Insulin.

Welche anderen posttranslationalen Modifikationen gibt es? kovalente Modifikation, chem. Modif. der Seitenkette der AS (s.u.), Knüpfen von Bindungen (Peptidbei Blutgerinnung) 1. Glykosylierung (ER) 2. Phosphorylierung (AMK-Mitochondrium) 3. Methylierung, Acetylierung, Hydroxylierung Ort: Lumes des ERs bzw. Golgi-Apparats, Mitos(Matrix)

VL 10 Posttranslationale Modifikation bei Eukaryoten Auf welcher Ebene findet bei Prokaryonten die Kontrolle der Genexpression statt? Transkriptionsebene über cis regulatorische Sequenzen gesteuert (Promotor, Enhancer, Silencer) Kontrolle Genexpression = Veränderung(Hemmung, Kopplung), abhängig vom Methylierungsgrad DNA Was bedeutet negative, was positive Kontrolle? negative = Hemmung Transkription positive= Unterstützung/Erhöhung Transkription(srate) neg. Kontrolle: Beispiel des lac-Operons. Operon= Bindungsort für Genprodukt des Regulatorgens Repressor : verkündet Bindung der Polymerase am Promotor Regulator=Promotor (CAAT-Box, GC-Box, TATA-Box) positive Kontrolle am Beispiel des lac-Operons

- induziert durch Induktor findet Bindung an Repressor statt - dadurch ändert sich Konformation und Repressor verliert Fähigkeit an Operon zu binden - somit Promotor frei, um Polymerase zu erkennen - polycis lac-mRNA gebildet und lac verstoffwechselt SCHLÜSSEL-SCHLOSS-PRINZIP Was ist cAMP biochemisch? cyclo-Adenosinmonophosphat = Energieträger für aktiven Stoffwechsel Was ist die physiologische Bedeutung? Eukaryoten (Transkriptionsebene)

Prokaryoten

komplexe Promotoren Transkription im Kern Modifikation

sofort in Protein übersetzt kein Kern-> kein Transport keine Modifikation

Enhancer verleihen mehr als volle Aktivität "Das Proteom korreliert zahlenmässig nicht mit dem Genom." Wie kann das sein? Nennen Sie Beispiele für Tertiär-Struktur-Motiven von Proteinen, die bei der Genregulation eine Rolle spielen?

Welche Eigenschaft der DNA-Struktur wird ausgenutzt? Anschlussfrage: Erläutern Sie kurz warum das so ist.

VL 12 gentechnische Methoden

Womit wird die bakterielle Zellwand enzymatisch zerstört? - mechan. Zerstörung oder enzym. Abbau Wozu dienen Detergenzien beim Zellaufschluss? - zerstören Membran Wie entfernen Sie Proteine? - Proteinase K zu Abbau Zellwand - Denaturierung oder Entfernung Proteins - Bindung DNA an spez. Säulenmaterial Nennen Sie mind. drei Faktoren, welche die Mobilität von DNA in Agarose-Gelen beeinflussen. - molekul. Größe + Konformation DNA - Agarosekonzentration (abh. Wanderungsv.) - I (I proportional zur v) Was ist ein Restriktionsenzym? - erkennen und schneiden bestimmte/palindrome Sequenzen der DNA Typ I : schneidet zufällig Typ III: schneidet im Umkreis 20-26 Seq Typ II: schneidet exakt a) glatt (stumpf, blunt) b) kohäsiv (überhängend, sticky) Nennen Sie wenigstens zwei molekularbiologische Techniken, die auf Hybridisierung beruhen. - Southern Blot(DNA), Northern Blot(RNA) - DNA/RNA-in-situ- Hybridisierung(direkt in Zelle/Zellkern/Gewebe) - (PCR) benötigt ssDNa, Primer(Forward und Reverse), AS, Puffersystem - ds aufgespalten in ss = Denaturierung (92 Grad) - Primer (sollten nicht komplemetär an 5´und 3´Ende sein-> Gefahr Haarnadelschleife) heften an = Annealing (50-50 Grad) - Polymerase & AS zugeben = Elongation (72 Grad) Beschreiben Sie kurz das Prinzip der Markierung durch Nicktranslation. Welches Enzym ist daran beteiligt? Welche Bestandteile müssen bei allen Reaktionen dieses Enzymtyps vorhanden sein? Bei welcher Technik brauchen Sie zwingend eine vergleichbare Reaktion? Was ist cDNA? Was ist ein Primer? Was ist eine (Gen-)Sonde? - kloniertes Stück eines Gens oder verwandte Seq...