17 Stress genotossico e immunogenicità PDF

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Sbobinature del corso di Patologia tenuto dal professore Ferrerio nell' anno 2018/2019. Si raccomanda lo studio delle sbobinature da affiancare al libro....

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Seminario STRESS GENOTOSSICO E IMMUNOGENICITA’ Patologia, 24/04/2014, Parte 2 Autore: Iaquinta Caterina Il mantenimento dell’integrità strutturale e funzionale della molecola di DNA è uno dei requisiti più importanti per tutti gli esseri viventi. Il sistema immunitario contribuisce al mantenimento dell’omeostasi dei tessuti. Per Genotossicità si intende la capacità di una sostanza di indurre delle modificazioni all’interno di una sequenza nucleotidica o della struttura a doppia elica del DNA di un organismo vivente. Molto spesso il termine Genotossicità viene confuso con quello di Mutagenicità. Tuttavia è importante notare che mentre tutte le sostanze mutagene sono anche genotossiche, non tutte le sostanze genotossiche risultano mutagene. Tornando al concetto di genotossicità, quindi alla capacità di una sostanza di indurre delle mutazioni, vediamo quali mutazioni appunto sono possibili. Le mutazioni sono di due tipi: -mutazioni germinali, che sono cosi chiamate perché possono essere trasmesse alla prole; -mutazioni somatiche, che interessano solo la linea cellulare mutata e possono portare alla formazione di neoplasie;

Stress genotossico I composti che interagiscono con il DNA delle cellule viventi e causano la perdita della integrità strutturale e funzionale del DNA, sono definiti genotossici. I composti genotossici inducono modificazioni stabili, quindi ereditabili, dell´informazione genetica (DNA). Gli agenti genotossici possono essere diretti e indiretti. Un danno genotossico può indurre: morte cellulare per apoptosi o necrosi,cancro, difetti congeniti, malattie ereditarie. I principali composti genotossici si distingono in: - composti organici: idrocarburi alifatici, composti aromatici e composti azotati; -composti inorganici: metalli pesanti e composti inorganici radioattivi. I danni al DNA possono essere anche causati dalle cosiddette ROS ( specie reattive dell’ossigeno) le quali, siano esse radicaliche o non radicaliche, possiedono attività ossidante. Molto importanti sono le mutazioni indotte dalle radiazioni non ionizzant (radiazioni UV, raggi X e raggi gamma,e raggi cosmici) e dalle radiazioni ionizzant (come le particelle alfa, elettroni, neutroni , protoni). Danno indotto da ROS (specie reattive dell’ossigeno): coinvolge la struttura primaria della doppia elica e può determinare: -ossidazione delle basi e generazione di interruzioni nei filamenti di DNA; -alchilazione di basi (generalmente metilazione); -Idrolisi di basi, come la depurinazione e la depirimidinazione; -mismatch (=disappaiamento) delle basi. Danno indotto da radiazioni: i danni recati al DNA possono dare un addotto al DNA (che è un frammento del DNA covalentemente legato ad una sostanza chimica,in genere cancerogena),o rotture della doppia elica (rotture che possono essere a singolo e doppio filamento), vi possono essere danni alle basi, o ancora danni ossidativi. I danni provocati ai cromosomi invece possono essere: la creazione di micronuclei, lo scambio dei cromatidi fratelli, o aberrazioni cromosomiche. Le conseguenze del danno genetico sono diverse; se il danno avviene nelle cellule germinali, si possono osservare: aborti spontanei, difetti congeniti, malattie cromosomiche, malattie mendeliane (legate alla X, autosomiche) . Se il danno avviene nelle cellule somatiche si possono verificare: morte cellulare, oncogenesi ( attivazione di protooncogeni e/o inibizione degli oncosoppressori) .

I meccanismi di risposta al danno al DNA sono di due tipi: -meccanismi genetici che riguardano i meccanismi di riparo del DNA o l’apoptosi ,che inducono la morte cellulare programmata di quella cellula per far si che il danno non venga ereditato dalla progenie; -meccanismi epigenetici come l’attivazione di particolari tipi di ligando-attivatori che interagiscono con la controparte recettoriale posta sulla superficie dei linfociti NK. La riparazione al danno del DNA può avvenire in maniera diretta, quindi per escissione delle basi o dei nucleotidi, o attraverso riparazioni di rotture del doppio filamento. Il meccanismo dell’apoptosi avviene quando una cellula è danneggiata anche nelle proprie capacità di riparazione, oppure infettata da un virus ed è uno dei meccanismi principali che si attiva nel nostro organismo . Il segnale apoptotico può venire dalla cellula stessa o dal tessuto circostante, o da cellule del sistema immunitario.

L’apoptosi può essere indotta dal gene oncosoppressore p53(anche Rb è un gene oncosoppressore) nel caso in cui il danno al DNA non può essere riparato. P53 blocca dapprima il ciclo cellulare per non far replicare il danno e attiva i geni coinvolti nel meccanismo di riparo del DNA .Se la riparazione non avviene p53 attiva i geni proapoptotici. Ci sono differenti tipi di situazioni che possono indurre geni proapoptotici( come blc2) ; i geni proapoptotici attivano una cascata di segnali che a livello mitocondriale provoca l’attivazione e il rilascio del citocromo c. Ciò porta alla formazione dell’ apoptosoma, costituito da procaspasi, citocromo c, e apaf1 (che è un gene che se attivato porta alla formazione dell’apoptosoma). Il risultato è un’ altra cascata di segnali che attivano altre caspasi ,cioè enzimi proteolitici che inducono il processo apoptotico. L’apoptosi ha una certa rilevanza nella regolazione della risposta immune, e può essere mediata da cellule del sistema immunitario quali: - Cellule T CD8 citotossiche che rilasciano citochine come Perforina e Granzimi, oppure l’interferone gamma, l’interferone beta o alfa. La perforina non è altro che una proteina che polimerizza per formare pori transmembrana mentre i granzimi sono una famiglia di tre serine proteasi.

Le cellule T CD8 citotossiche inducono l’apoptosi attraverso interazioni che si verificano fra le molecole di superficie delle cellule T citotossiche e la cellula bersaglio e grazie anche all’espressione del ligando FAS che si lega alla controparte recettoriale FAS esposta sulla superficie delle cellule bersaglio. Tali interazioni inviano segnali che attivano nella cellula bersaglio un programma apoptotico. Molto importante nella risposta al danno del DNA è il ciclo cellulare, in particolare i diversi check points (punti di controllo) del ciclo cellulare, che servono a massimizzare le opportunità di riparazione del DNA, e consistono in fasi specifiche in cui la cellula risulta essere in uno stato quasi di quiescenza e può essere riparata da tutti quei meccanismi che si attiverebbero nel caso in cui vi sia un danno.

Come mostrato nell’immagine, i punti di controllo fondamentali presenti nel ciclo cellulare si trovano nella fase G2, nella fase G1 e nella fase M dove è presente il punto di controllo dell’assemblaggio del fuso. A questi livelli la cellula viene bloccata, non cresce più, per far sì che gli eventuali danni vengano riparati. Il ciclo cellulare viene regolato da una serie di molecole come le Cicline che inducono o inibiscono lo stesso ciclo cellulare. In una cellula quiescente ad esempio, troviamo la proteina Rb, in forma ipofosforilata, che forma un complesso con il fattore di trascrizione E2F e la istone deacetilasi, mantiene la cromatina in forma compatta e quindi trascrizionalmente inattiva. La fosforilazione di Rb ad opera dei complessi ciclina/CDK provoca l’allontanamento della istone deacetilasi e consente ad E2F di trascrivere geni fondamentali per la proliferazione cellulare. Riassumendo: La risposta al danno del DNA si riduce in 3 punti principali: -riparazione del DNA; -ciclo cellulare attraverso i diversi check points; -processo di apoptosi, che provoca morte della cellula danneggiata e la sopravvivenza dell’organismo. Tra i meccanismi epigenetici nel controllo del danno genomico, troviamo l’attivazione della trascrizione per geni codificanti per i recettori attivatori delle cellule NK come ad esempio NKG2D e DNAM-1. I linfociti NK hanno sia recettori inibitori che recettori attivatori. Una maggiore espressione dei recettori attivatori e una minore espressione dei recettori inibitori,come i KIR, determina attivazione dei linfociti NK; al contrario una presenza maggiore di segnali inibitori,come accade in situazioni fisiologiche,inibisce i linfociti NK.

L’alterazione della risposta o riparo al danno del DNA e dei meccanismi di controllo del ciclo cellulare e dell’apoptosi sono spesso strettamente associati con lo sviluppo del cancro. Tali meccanismi sono parte integrante delle difese cellulari, finalizzate a contrastare lo sviluppo tumorale dopo irradiazione. Vi sono dei geni che regolano la divisione cellulare attraverso trasduzioni di segnale, come gli oncogeni che vengono definiti come la controparte dei geni normali e gli oncosoppressori che invece regolano negativamente la crescita cellulare. Tra gli oncosoppressori troviamo il gene P53. Come funziona P53: prendiamo ad esempio delle cellule normali che hanno uno status di P53 normale e cellule che hanno subito una mutazione o perdita del gene che codifica per P53; in questi due tipi di cellule induciamo a questo punto un danno al Dna attraverso le radiazioni ultraviolette. Vediamo che nella cellula che presenta uno status normale di P53 ,in seguito al danno al dna: -P53 si attiva, legandosi al DNA attraverso una specifica porzione interna; - attiva una serie di geni che inibiscono le CDK che regolano il ciclo cellulare (tra cui P21 che è il principale gene coinvolto nell’evoluzione del ciclo cellulare). -P21,una volta attivato, induce l’arresto della fase G1 del ciclo cellulare della cellula sana; -si attiva anche un'altra serie di geni come GADD45 (coinvolti nel meccanismo di riparo del DNA); - il riparo avviene correttamente e la cellula ritorna ad acquisire la sua funzione normale. Al contrario se questi due meccanismi di attivazione di P21 e GADD45 vengono meno e quindi il riparo del DNA fallisce, P53 attiva una serie di geni apoptotici che inducono la cellula a morire appunto per apoptosi. Nella cellula con una mutazione o perdita di P53: - il danno al DNA si esplica; - p53 non viene attivato; - non si ha l’arresto del ciclo cellulare; - non si ha il riparo del DNA; - le cellule mutate continuano a crescere e si sviluppa il tumore. Applicazione terapeutche combinate farmaco- immunologiche Si è visto che agenti chemioterapici, stress genotossico, raggi UV determinano danni al DNA che portano alla trasduzione di alcuni segnali che attivano alcuni geni effettori,i quali a loro volta inducono una risposta a livello cellulare, come l’attivazione dei geni ATM e ATR . L’attivazione di ATM induce l’apoptosi, l’arresto della crescita cellulare e il riparo del DNA,portando ad un ripristino della cellula normale, mentre un difetto in ATM al contrario non può determinare un riparo del DNA,anziché arrestare la crescita determina un aumento della popolazione dei geni con conseguenti mutazioni successive, portando cosi ad un processo di cancerogenesi. Mutazioni nel gene ATM causano un disordine genetico nell’uomo, noto come ATAXIA TELENGECTASIA, caratterizzato da degenerazione celebrale,immunodeficienza,predisposizione al cancro, sensibilità acuta alle radiazioni. Gli individui affetti da tale malattia, sviluppano una leucemia a cellule T, una leucemia linfocitica cronica da cellule B. Esistono dei recettori stimolatori del sistema immunitario innato ,come NKG2D espressi dai linfociti NK ma anche dalle cellule T CD8, che riconoscono le molecole self che sono indotte in cellule che sono state danneggiate. L’attivazione del ligando NKG2D è regolata dall’attivazione di ATR,ATM o ChK1.

Come mostrato nell’immagine, alcuni studiosi hanno visto che in cellule stressate da una grande varietà di stimoli, il sistema immunitario innato poteva riconoscere le cellule tumorali grazie a un aumento dell’espressione sulla superficie di queste cellule, dei ligando-attivatori. La curva vuota rappresenta le cellule non colorate con nessun anticorpo, mentre la curva piena rappresenta le cellule colorate con un anticorpo specifico. Queste curve dimostrano che l’espressione dei ligando attivatori è regolata dall’attivazione di ATM e ATR. Naturalmente si tratta di cellule tumorali in cui è stato indotto uno stress. In conclusione tale lavoro dimostra che diversi tipi di agenti genotossici come quelli chemioterapici possono incrementare l’espressione del ligando NKG2D , quindi facilitano l’attivazione dei linfociti NK nel determinare la lisi della cellula tumorale target. Questi esperimenti possono essere validati nei saggi di linfocitotossicità: una volta che stabiliamo che quella linea cellulare tumorale esprime i ligandi attivatori, seguiamo dei saggi di linfocitotossicità mettendo a contatto cellule NK e cellule tumorali che esprimono i ligando attivatori, in seguito all’interazione otteniamo un aumento della lisi indotta dai linfociti NK dimostrando che un aumento della lisi indotta dai linfociti NK potrebbe essere dovuto ad un aumento ,sulla superficie delle cellule target, dei ligandi attivatori. Processo di progressione del cancro e possibili barriere intrinseche ed estrinseche in un processo di cancerogenesi. Partiamo da cellule di un tessuto normale che vedono l’attivarsi di segnali proliferativi che inducono la formazione di una lesione precancerosa; ciò avviene in seguito a mutazioni di geni specifici, geni oncosoppressori. Successivamente si ha lo sviluppo di un cancro a livello precoce, quindi anche qui si ha la mutazione e la perdita di geni oncosoppressori come P53; nella fase in cui il cancro si sviluppa ma è ancora in situ la risposta al danno al DNA determina l’attivazione di P53 e altri geni oncosoppressori, è a questo livello che entrano in gioco le barriere intrinseche che arrestano il ciclo cellulare, la senescenza e l’apoptosi, e le barriere estrinseche che riguardano l’espressione di superficie di ligandi attivatori sulle cellule tumorali, che determinano l’attivazione di una risposta immunitaria cellulo-mediata, che potrebbe facilitare in qualche modo l’eradicazione del tumore a opera di cellule del sistema immunitario come le cellule NK. Quando questo non avviene il processo cancerogenetico progredisce. Concludendo: in un processo di cancerogenesi , cellule tumorali esprimono sulla loro superficie, dei ligandi che ingaggiano i recettori attivatori posti sulla superficie delle cellule NK e in alcuni casi delle Cellule T. Spesso questi pathway di segnalazione sono responsabili dei meccanismi di soppressione del tumore, indotti da P53 ad esempio, che non solo induce l’apoptosi, ma è anche un regolatore della senescenza cellulare. L’induzione dei ligandi NKG2D in risposta al danno al DNA risulta essere presente in cellule che hanno perso l’espressione di P53....