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Cours de biologie cellulaire ...

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Architecture membranaire: protéines

Radeau lipide ou Lipid raft: •Territoire particulier de la membrane plasmique enrichie en sphigomyéline et en cholestérol: c'est les radeau lipidique, zone membranaire un peu plus épaisse d'un côté comme de l'autre car plus de sphingomyéline (1 chaine d'AG qui est saturé donc plus longue et va pénétrer de façon plus importante dans la membrane rigidifie). Dans le feuillet interne des AG plutôt saturé. •C'est moins fluide au sein même de ces radeau lipidique: autour c'est très fluide mais dedans c'est plus rigide (à cause du cholestérol). •Ils servent de lieu privilégier pour le regroupement de protéines qui vont s'encrer dans la membrane: la plupart du temps c'est des récepteurs, protéines transmembranaire mais aussi des protéines de signalisation: à ancre GPI par exemple. •La cavéoline: protéine membranaire qui ne traverse pas complètement la membrane •Protéines prion: la PRP, c'est une protéine à ancre GPI qui est résidente des Lipid raft (que se soit la PRP normal ou la PRP pathologique) Protéine pathologique anormalement replié, la PRP normal transformer en PRP pathologique se fait au sein même de ces radeau lipidiques. Cette PRP pathologique va être internalisé dans le cytoplasme pour être adresser ou non au protéasome. •Ces lipides raft ont des interactions non covalente entre les lipides, qui sont incapable d'être désorganisé par des détergent. Quand on utilise des détergents, ils sont insolubles: c'est se qu'on appel les DRM (détergent résistant membrane) propre au lipide raft: permet de les dissocier des autres parties de la bicouche lipidique.

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Les protéines membranaire: Bicouche lipidique: les protéines qui confère les fonction à la membrane La fonction de ces protéines:    

Le transport: des nutriments, des ions, …. Rôle de liaison: Les protéines de liaison vont pouvoir lier d'autres molécules de part et d'autre de la membrane Rôle de récepteurs: elles vont être un relais entre la signalisation, permettre de capter des signaux à l'extérieur et le transmet à l'intérieur  cascade de signalisation Enzymes: toutes les enzymes sont des protéines: catalyser des réaction biochimiques spécifiques

Rappel sur les protéines: •Structurées par un enchainement en AA, ajouté de façon linéaire, lié entre eux par des liaisons covalentes (Atomes-Atomes)= liaisons peptidiques. Tous les AA possède un squelette peptidique commun, elle vont différencier par des résidus latéraux de part et d'autre du squelette, cet ajout se fait obligatoirement entre un groupement carboxyle et un groupement amine à l'extrémité Nterminal de l'autre AA: polarité directionnel, structurel •Rend chaque AA distinct: 20aine d'AA différents qui rentre dans la production de protéines. •Parmi ces chaines latérales: certaines hydrophile (AA chargé et AA non chargé), ils vont avoir une affinité avec l'eau donc soit sur le versant extracellulaire soit cytosolique, d'autre orienté par des parties hydrophobes, à l'intérieur des membranes. •Ils sont enchainés les uns à la suites des autres avec un ordre particulier: structure primaire d'une protéineséquence en AA. •Niveau d'organisations supplémentaire, car elle doit être replié: organisation spatial qui peut aller jusqu'à 4 niveau de structuration: primaire, secondaire, tertiaire et quaternaire Structure secondaire: repliement local de cette chaine polypeptidique:

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Elle peut se replier selon 2 méthodes:   

La protéines est capable de réaliser des hélices alpha Soit en feuillet Β  extrêmement bien définit Stabilisés par des liaisons hydrogènes Il existe aussi des structure pas très bien définie structure non définie

Cette structure secondaire va permettre de former la structuration tertiaire qui décrit le repliement de l'ensemble des structures secondaires d'une protéine •Protéines: une structure pour être fonctionnel, cette structure 3D, tertiaire, est propre, adapté à la fonction de la protéine, elle fait intervenir des ponts disulfure, des liaisons covalentes entre 2 atomes, et l'emble de toutes les liaisons non covalentes qui permettent de stabiliser et de replier localement cette structure secondaire, afin que la protéine acquiert sa fonction. Ici structure 3D, intimement lié à sa fonction et expérimentalement on est capable de la casser en utilisant des agents dénaturants protéine perd sa fonction. •Une protéine monomérique: une seule sous-unité, elle sont capable d'adopter une structure tridimensionnel Une grande partie des protéines sont multimériques= plusieurs sous unités, capable de s'engager dans la structure quaternaire, pour agencer ces sous unités entre elle: la structure quaternaire de la protéines: protéines comme des dimère, 2 sous unité identique: monodimère. Hetérodimère :2 sous unités différentes Trimère: trois sous unité, trois sous unité identiques. Liaison non covalente permette de stabilisé la structure multimérique de la protéine •Protéine fonctionnel: possède une fonction Certaines sont fonctionnel mais peut être soit active soit inactive: changement de conformation, c'est le cas de l'intégrine, c'est un dimère (2 sous unité différentes)  hétérodimère. Cette intégrine fonctionnelle peut passer d'une conformation inactive à active, inactive: replier vers l'intérieur, elle doit se déployer pour exposer des motifs de liaison pour par exemple aller fixer un liguant, ce changement de conformation est dépendant des mécanismes de signalisation. •Lorsqu'on connait la structure primaire d'une protéine on est capable de prédire cet agencement, se repliement de protéine, juste en regardant le profil d'hydropathie on est capable de savoir si une partie va plutôt être orienté vers l'intérieur ou l'extérieur et donc de dire si elle est capable de faire des hélices alpha, des feuillet beta,….

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Association des protéines membranaire avec la bicouche lipidique: 1935: les chercheurs ont vite compris que les membranes biologique n'étaient pas composé que de lipide. Ils pensait qu'il y avait que des protéines périphérique qui ne traversaient pas la membrane, qu'elles étaient posé de part et d'autre de la membrane c'est la modèle Danielli 40 ans après: Les techniques de froid et de microscopie, les protéines sont capables de traverser la membrane, lorsqu'il ont fait la cryofracture: relief présence de protéines transmembranaire 1972: Principe de la mosaïque fluide découverte par deux chercheurs: SINGER et NICOLSON grâce à eux qu'on à compris que les protéines traversaient la membrane, c'est le modèle de la mosaïque fluide: décrit la composition et le comportement dynamique des membranes. Mosaïque car asymétrie membranaire, hétérogène dans l'espace et dans le temps, protéines de nature diff entre feuillet interne et externe (elle s'insert différemment) + les sucres Fluidité: phospholipides peuvent bouger, les protéines aussi. Asymétries des protéines dans la bicouche

Les protéines membranaires:

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•Protéines transmembranaire (70%): Molécule amphiphiles, régions hydrophobes et hydrophiles pour traverser la bicouche lipidique, elle peuvent traverser en réalisant des hélices alpha: soit avec une seul ou plusieurs hélices alpha -Les protéines en hélice alpha: •La plus rependu pour les protéines, elle est énergétiquement favorable pour traverser la membrane en exposant les chaines latérales hydrophobe alors qu'elle enfouit les chaines latérales hydrophiles. Stabilisé par des liaison hydrogène non covalente. •Soit un seul passage transmembranaire: Single pass protéine (exemple de la glycophorine, protéines transmembranaire single pass spécifique de la membrane plasmique de l'hématie) Pour traverser une membrane: Il faut une 20aine d'AA, on retrouve les AA hydrophobe (en vert) orienté vers les phospholipides, alors que les AA hydrophiles (jaune et bleu): à l'intérieur de l'hélice alpha, plus d'AA hydrophobe que d'AA hydrophile. Si on remarque qu'il y à plus d'AA hydrophobe on aura plutôt une protéine en hélice alpha plutôt qu'en feuillet beta. L'index d'hydropathie: On peut reconnaitre la partie transmembranaire de la glycoproténe (ici de la glycophorine) •D'autre protéines sont capable de traverser plusieurs fois la bicouche: protéines à plusieurs domaines transmembranaire (jusqu'à 12): Multi pass protéine (ici 5 domaines transmembranaire): AA hydrophile orienté vers le cœur (rouge) de la structuration et inversement. Ils sont relier entre eux par cette structuration non définie qui permet de continuer l'agencement en AA. On à une perméases (Glut): protéines multipass, ou la protéine Band 3 -Feuillet Beta: •Capable de traverser la bicouche de façon incurvé en formant un tonneau ouvert à ces deux extrémité. Brin béta: structure de base Un brin beta seul est instable: fait d'engager plusieurs brin beta qui stabilise la protéines feuillet beta. Une protéine en feuillet beta n'est JAMAIS single passe. Le brin béta est stabilisé par des liaisons hydrogène avec d'autres feuillet beta. Chaine hydrophile orienté vers l'intérieur et inversement. Exemple d'une porine bactérienne et des porines dans la membrane mitochondriale. Parmi les protéines transmembranaire: en hélices alpha et à feuillet Beta, la cavéoline est une protéine membranaire, et pas transmembranaire, elle ne traverse pas totalement la membrane!!

•4ème agencement: protéine membranaire comme la cavéoline elle n'est pas transmembranaire, ne traverse pas complètement la bicouche lipidique, elle va s'ancrer uniquement sur le feuillet interne, cytosolique de la membrane. Conformation en hélice alpha qui va pas traverser la membrane, nombre d'AA plus restreint que 20 AA.

•Protéine à ancre lipidique: Ne traverse pas non plus la bicouche, rattaché par un ou plusieurs groupement lipidiques par des liaison covalentes et ces groupement lipidiques: ancres lipides protéines à ancre lipidique qui s'ancre sur un seul feuillet membranaire, ce lipide appartient totalement à la protéine car il est lié de façon covalente, il sont ajouté lorsqu'on à la biosynthèse de ces protéines lors de la traduction. Il existe plusieurs classe de protéines à ancre lipidique qui dépendent de la réaction enzymatique mise en place lors de la biosynthèse, on va avoir des réaction enzymatiques qui vont permettre de lier à une protéine des ancres différentes. On va trouver des ancre: Sur la face interne: Ancre myristoyléee, palmitoylée, isoprénylée: uniquement sur la face interne, un AG, il faut savoir que se sont des lipide. Sur la face interne, protéines à ancre lipidique dont les petites protéines G, très importante pour la signalisation: super famille Ras, les petites protéines Rav, protéines avec des ancres myristoyléee, palmitoylée, isoprénylée sur le versant interne. Sur la face externe: Protéines à ancre GPI: la PRP face extra cellulaire, ancrage se fait sur un phosphatidyl-inositol, 4 sucres en plus de l'inositol un acide phosphorique et un éthanolamine lié directement à la protéine feuillet externe. Protéines à ancre lipidique qui ne traverse pas complètement, si en plus se sont des lipides, ces protéines vont permettre de bouger, elle confère une grande mobilité aux protéines au sein de ces membranes, bouge rapidement, en général engagé dans des processus de signalisation. Si y'a une signalisation elle vont bouger, elle bouge d'autant plus rapidement qu'elles ont des ancres lipidiques.

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Protéines périphériques (30%): de part et d'autre de la membrane, se lie grâce à des liaison non covalente à des protéines transmembranaire: protéines périphérique interne et externe. Elles sont capable de lier soit des éléments du cytosquelette (périphériques interne), externe: peuvent se lier aussi à des protéines de la matrice extracellulaire. Exemple de la protéines 4.1, la laminine, fibronectine. Elles sont rattachés par des liaisons non covalentes aux protéines transmembranaire, interaction aussi avec des protéines à ancre lipidique. On peut les extraire plus facilement que des protéines qui traverse la membrane. Les protéines membranaire intimement lié à la membrane (transmembranaire, cavéoline et à ancre lipide, elles sont intégrés à la membrane) sont isolé et purifié par des détergents ou des solvants organiques qui viennent casser la bicouche lipidique. Si on les sort, on casse leurs structuration et donc leurs fonction. A l'inverse les protéines périphériques, on peut les isolé avec des solution salines ou en jouant sur des variations de pH. Permet d'isoler les protéines périphériques sans détruire la membrane, structure de la protéine conservé donc la fonction aussi. De nombreuses protéines sont glycosylées:

Les lipide peuvent être glycosilé aussi, ces sucre sont orienté uniquement sur des faces de la membrane. Sucre qui se fixe sur des protéines, lié de façon covalente (participe à l'asymétrie membranaire) . Ceux sur le versant extracellulaire formation du cell-coat, cette ajout de sucre se fait en bloc pour les glycoprotéines par des étapes de glycosilation ou de façon linéaire pour les protéoglycanes. On à les glycoprotéines et les protéoglycanes. Rappel sur les sucres: oses, principal source d'E des cellules végétales et animales. Sucre monosaccharidessucre simple (glucose, fructose, lactose, ….). Ces sucre sont capable d'être engagé dans les liaison pour former des disaccharides

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Les chaines courtes (une 10aine de sucre): oligosaccharide, comme les mécanismes de glycosilation protéines avec des chaines sucré oligosaccharide. Enchainement de sucre plus long: polysaccharide (une 100 aine voir des milliers de sucres) •Les glycoprotéines: Lié de façon covalente à des chaines courtes glucidiques oligosaccharide. Peuvent être N ou O glycosilée. •Les protéines N-glycosilées: ajout de sucre sur l'atome d'azote d'un AA particulier qu'on appel l'asparagine d'une protéine. Commence dans le RE et se poursuit dans l'appareil de Golgi. On retrouve à l'extrémité de la ramification des acide sialiques (chargé négativement) •Les protéines O-glycosilées: ajout de sucre sur l'atome d'Oxygène sur un résidu particulier: soit une cérine soit une tréoline, commence uniquement dans l'appareil de Golgi on est dans les cytomembranes, tourné vers la lumière des compartiments de la cytomembrane Rappel: N glycosilation  Asparagine, RE  Golgi Acide sialique O glycosilation Serine ou Thréonine  Golgi •Protéoglycanes: Protéines qui vont porter de longues chaine latérales de polysaccharides (100aines de sucres les uns à la suite des autres), à la diff des glycoprotéines ne sont jamais ramifié, ces chaines= glycosaminoglycanes (=cet enchainement de sucre), il vont pouvoir se greffer sur une protéine pour former des protéoglycanes. Lié de façon covalente, ils sont relié à la protéine à un linker sucré qui va se greffer sur la protéine par l'intermédiaire de l'Oxygène d'une cérine ou d'une tréolineprotéoglycanes

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Les protéoglycanes sont obligatoirement O-glycosilé, cette O-glycosilation se fait soit sur une cérine soit sur une thréonine dans l'appareil de golgi, les sucres représente jusqu'à 90% de la masse de la protéine, empêche la protéine de se replier, encombrement important qui l'empêche de se replier, ces GAG, assemblage de 10 saccharide répété n fois, chargé négativement. Premier sucre chargé obligatoirement négativement, il peut être sulfaté, ils sont donc hydrophile et peuvent retenir une énorme quantité d'eau. Ils sont capable de retenir l'eau autour. On peut avoir une protéine avec une seul GAG ou plusieurs GAG, peuvent être de nature identique ou différente. Il existe 4 groupe de GAG: 

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3 grand groupe se lie à une protéine de façon covalente, ils sont sulfaté, on ajoute une modification, une sulfatation sur l'ose qui est en rose. So42- =charge négative supplémentaire, ils peuvent se fixer sur des protéines transmembranaire mais il peuvent aussi être de façon libre dans le cytoplasme L'acide hyaluronique: un GAG particulier, il n'est pas sulfaté, il est synthétisé par le fibroblaste (dans la matrice extracellulaire capable de synthétiser des constituants de la matrice de la MEC, il est incapable de se lier de façon covalente à une protéine, il ne peut pas constituer un protéoglycane peut participer à la formation du cell-coat car capable d'interagir avec le récepteur CD44, protéine transmembranaire à la surface de la membrane plasmique, récepteur pour l'acide hyaluronique. Cet acide hyaluronique participe donc à la formation du cell-coat. Très important dans des mécanismes d'inflammation cellulaire ,c'est le couple acide hyaluronique, récepteur CD44 qui joue un rôle dans la cicatrisation, créer un œdème pour pouvoir réparer le tissu grâce à l'eau. Acide hyaluronique: que des sucre. Capable de se lier à la membrane de façon non covalente ou libre dans la matrice extracellulaire.

L'ensemble GAG: très volumineux polysaccharides qui retiennent l'eau de façon très importante pour réaliser les œdème cutané qui vont permettre les processus de réparation cellulaire. L'ensemble de tous les sucres au sein même de cette membrane plasmique représente le cell coat, manteau très glucidique très important.

•La mobilité des protéines: Comme les lipides elles sont capable de bouger dans le plan de la bicouche, elle bouge en fonction de la signalisation. Se mouvement à été démontré par l'expérience de FRYE EDIDIN, expérience de l'hétérocryon. On plonge des cellule de souris avec à leurs surface des protéines qui leurs sont propre, on met aussi des cellules humaine avec des protéines spécifique. On fait fusionner les 2 cellule pour donner naissance à une cellule hybride= l'hétérocaryon qui possède une partie de chaque membrane, les protéines juste après la fusion sont cantonner sur un demi hémisphère et les autres sur l'autre côté. On met des Ac soit spécifique des protéines de souris (avec un florocrome comme la fluorecérine) et aussi des Ac spécifique des cellules humaine avec un autre fluorocrome (la rhodamine). Ils vont se fixer, on incube ces cellule (à 37°C: T° physiologique) pendant 40 min, en Microscopie confocale, on remarque que la fluorescence est répartie sur toute la membrane (rouge ou vert) en superposant les deux images: marquage jaune de colocalisation. 9

Cette technique à montré que les protéines pouvaient bouger au sein de la membrane plasmique à 37°C (alors qu'à 4°C on aurait la même répartition qu'au temps 0), les protéines sont restreinte quand on fige les membrane à 4 °C.

Elle diffuse latéralement, mais beaucoup moins vite que les lipides: Rotation sur leurs axe Incapable de basculer d'une couche à l'autre, par contre certaines vont cataboliser les mécanismes de flip flop des lipides. Certaines protéines sont quand même restreintes à certaines zones parce qu'elles doivent réaliser des fonction spécifique. Comme les protéines liées à des éléments du cytosqueletteempêcher une mobilité complète de ces protéines. Mobilité restreinte dans le sens inverse: certaines protéines peuvent aussi se lier à des éléments de la matrice extracellulaire, des protéines déjà engager dans des mécanismes de reconnaissances ou d'adhésion sont beaucoup plus stable (exemple reconnaissance, mécanisme d'adhésion cellules-cellules contexte tissulaire, jonctions Les protéines qui reconnaissent les protéines entre deux cellule sont restreintes à ces mécanismes d'Adhésion Dans un contexte également tissulaire, une grosse majorité des cellule sont polarisée parce qu'elle sont lié avec les cellule avoisinante avec des jonction (Tight jonction) cohésion cellulaire, ces jonction étanche vont restreindre des protéines soit sur le versant apical soit sur le versant baso latéral Les protéines sur la partie baso latéral ne peuvent pas passer les jonctions étanches, les protéines de la face apical peuvent aussi uniquement bouger que sur le pôle apical dans le cas des cellules polarisées.

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Les frontières de la membrane plasmique: Une grosse majorité des cellule polarisé (dans un contexte cellulaire). Ces cellule sont capable de se juxtaposé pour former un tissu épithélial, de revêtement (PHOTO) tissus épithélial uni stratifié, elles possède un pôle apical et un baso latéral, elles sont jointes par des phénomène de jonction cellula...